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[实验技术]大量制备质粒方法
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大量制备质粒方法 由于动物免疫试验需要的质粒量比较大，并且对质粒的浓度和纯度要求比较高，所以用于动物免疫试验的质粒采用大量法提取，具体步骤如下： (1) 将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体培养物进行接种。 (2) 将含相应抗生素的500ml LB液体培养基(预加温至37℃)中放入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时(摇床转速300rpm/min)，所得培养物的OD 600值约为0.4。 (3) 用合适转头于4℃以5, 500 rpm/min，离心15min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。 (4) 将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物重悬于10ml溶液Ｉ中。 (5) 加20ml新配制的溶液Ⅱ。盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10min。 加15ml用冰预冷的溶液III。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10min，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。 (7) 用合适转头于4℃，以5, 500 rpm/min，离心15min，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。 上清过滤至250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置30min。用合适转头于室温以12, 000 rpm/min，离心15min，回收核酸。 (9) 小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。 (10) 用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。 (11) 将核酸溶液所得转入15ml离心管中， 再加3ml用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于４℃下以10, 000 rpm/min，离心10min。将上清转移到另一30ml离心管内，加6ml的异丙醇，每管加750μl，放置30min以上，可过夜。充分混匀，于室温以10 000转/分离心10分，回收沉淀的核酸。 (12) 小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几min，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。 (13) 用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温水浴30min，37℃。 (14) 用酚：氯仿抽提，12, 000rpm，离心8min，取上清并加入等体积的氯仿抽提，12, 000rpm，离心8min。 (15) 用1/10体积的NaAc(3M)，无水乙醇800μl，沉淀核酸，12, 000rpm，4℃，5min， (16) 沉淀用70％乙醇洗，12, 000rpm，10min，沉淀加800 μl灭菌水，加500 μlPEG-MgCI2(PEG-6000，20％，30mM NaCl2)，放置10-15min，12, 000rpm，10min， (17) 沉淀中加500 μl70％乙醇(除去PEG)，12, 000rpm，5min，重复一次。 (18) 干燥，挥发乙醇，加500 μl生理盐水，测1:100的OD值。 |
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