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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR鉴定小鼠基因型 老是p不好 出现拖尾的条带 请各位大神分析分析!
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aerbeizi

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR鉴定小鼠基因型 老是p不好 出现拖尾的条带 请各位大神分析分析! 已有1人参与

本人在养基因敲除小鼠,但是在基因鉴定的时候卡住了,pcr做不好,引物用的是jacksonlab上的推荐引物,pcr用的退火温度大约是引物Tm值低3-5度.开始提取小鼠脚趾DNA用的方法是别的实验室告诉的NaOH裂解法，200ul 50mM NaOH 100℃ 1hr ，加20ul tris ph8.0 中和 ，但是pcr的时候p不出来，后来改用了传统的方法提取DNA，p出来又出现了新的问题，见图，特此向各位大神帮忙哈！

floxed mice.jpg
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1楼 2013-04-07 23:00:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉模板加多了。你提完DNA做定量了吗？
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2楼2013-04-08 01:08:20
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aerbeizi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-08 01:08:20
感觉模板加多了。你提完DNA做定量了吗？

做了定量，模板最后终浓度约6-15ng/ul，这样算很高吗
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3楼2013-04-11 09:26:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by aerbeizi at 2013-04-11 09:26:36
做了定量，模板最后终浓度约6-15ng/ul，这样算很高吗...

应该不算很多，一般50μl体系加100-200ng基因组DNA。
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4楼2013-04-11 13:20:43
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hxm007199

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你下面那排的marker呢？哪些孔是你的样品？
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生可忍，熟不可忍！
5楼2013-04-11 17:38:08
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hxm007199

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你用总dna做pcr，可以加多点模版，200ng应该比较合适
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生可忍，熟不可忍！
6楼2013-04-11 17:39:20
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alicemenglei

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也出现了同样的问题。有的又跑出来 有的没有，而且同样基因型条带还不齐。你找到解决办法了么？
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爱笑的女生运气都不会太差
7楼2013-08-17 15:18:38
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

出现片状拖带或涂抹带的一般问题与解决方法
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其解决方法一般是：1.减少酶量，或调换另一来源的酶。2.减少dNTP的浓度。3.适当降低Mg2+浓 度。5.增加模板量，减少循环次数。
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8楼2013-08-18 18:16:25
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chengchy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也遇到了这样的问题，求此问题怎么解决的呢？
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9楼2015-03-05 15:26:17
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旭曦追梦

新虫 (小有名气)
刚开始实验的新手，前来学习，请多指教！谢谢！
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10楼2015-11-27 09:53:42
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