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gene121

木虫 (著名写手)

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[资源] RACE-PCR克隆基因的几点建议

RACE是一种快速克隆cDNA末端的方法，目前, 该方法被广泛应用于未知碱基序列基因的克隆，尤其是SMART　RACE技术更为人们所青睐。本文总结了我们实验室用SMART　RACE技术克隆基因的一些心得体会，希望对用RACE方法克隆基因的同行有些帮助。

　真核细胞的mRNA在加工过程中其3'末端加上一段Poly A，这是利用反转录酶制备cDNA文库的基础，但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，曾经是一个令人困扰的问题。80年代末、90年代初发展起来的一种快速获取cDNA全长的方法，即RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)，目前这个方法被广泛用于克隆各种未报道的基因，该方法基于PCR技术，步骤少，耗时短，且经济节省，只需知道mRNA内部很短的一段序列或一小段cDNA（如EST）即可用此法克隆出未知的序列。目前，RACE已经不局限在克隆cDNA上，在克隆cDNA相邻序列以及基因组片段等方面也得到越来越广泛的应用。RACE技术使传统筛库的方法寻找全长基因的过程从几个月，缩短为几天。尤其对于低丰度基因的克隆优势更为显著[1]。

我们实验室用在合成cDNA的双链后，在两端连上接头引物，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增,分别从水稻和小麦中克隆到了TPT[2,3]。但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。此外，由于mRNA容易降解，很难确定得到的cDNA是全长的cDNA，还是 cDNA的片断？

RNA反转录5’末端交换机制（Switching Mechanism At 5' end of the RNA Tran，SMART）技术的出现是一个新的里程碑。其原理如下：在合成cDNA的反应中，事先加入的5'末端带Oligo（dT）的SMART引物（如 5'–(T)25N-1N–3'，N = A, C, G或T；N-1 = A, G或 C），由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的 cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo　dG（5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG–3'）与合成 cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列（5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACG–3'），合成第二链后可以利用通用引物（UPM（Universal Primer Mix， Long：0.2mM，　5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'，Short： 1mM，5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'）与NUP(Nested Universal Primer，10 mM，　5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'）进行扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。这个方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的总RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的 mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、利用部分已知序列克隆全长cDNA，和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等[4]。但对多数实验室来说，用于做RACE的试剂盒太昂贵，对于一些经费充足的实验室，虽然有RACE试剂盒，但总会碰到一些的问题，以下就做RACE的核心问题发表一些见解，供大家参考。

用于RACE引物设计的原则

引物设计的优劣对于做RACE是至关重要的，如果引物的特异性不好，就会给实验带来许多麻烦，甚至扩增不到我们这实验预期想的目的产物。以下是结合一些网上的资料和我们在多次实验中总结出的引物设计的原则。

兼并引物的设计　用兼并引物扩增，一般是我们想克隆的物种中没有我们想要克隆的目的基因的信息，但在其它物种中是存在的，我们就可以将其它物种该基因的序列进行序列同源性比较，同源性高的区域就是兼并引物设计的侯选区；或是假如这些基因的核酸序列的同源性不高，没有合适的选择区域，则我们可以用将其它物种该基因的序列翻译成氨基酸序列，然后进行序列同源性比较，同源性高的区域一般是保守区，再用保守区氨基酸对应的核酸序列设计兼并引物，但兼并引物兼并度（即单条引物上各兼并碱基之和的乘积）应小于1000 ，且兼并引物的3’端应尽量减少兼并性，并使3’端最后6个碱基的G或C的含量大于50%，以提高特异性；此外，假如我们只知道氨基酸序列，则可根据不同物种密码子的偏好性来设计引物。1.2　有部分碱基序列的引物设计　对于用差异显示 (Differential Display Reverse Tranion ,DDRT)或者抑制减法杂交（Suppressive Subtractive Hybridization ，SSH）、RNA指纹、EST芯片及兼并引物扩增等方法得到DNA片断，要克隆全长cDNA，或者用同源序列克隆其他物种中的同源基因，3'端的扩增一般都不成问题，难就难在5'端的片断扩增。利用SMART技术将SMART引物自动加入cDNA的5'端，不但能避免加接头或者加一串碱基的麻烦，而且能得到全长的cDNA 5'端。只要少至25个碱基的已知序列即可克隆出全长的cDNA[4]。

如你欲克隆的基因在GenBank已列出的26种生物中，且是多基因家族的一个成员，则应先上网进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，为了提高扩增的特异性，应选择没有同源性的区域设计引物。基因特异性引物（gene special primer，GSP）和套式引物 (nested primer，NP)的长度以23~28个碱基为宜，GC含量50%以上，且GSP的5’端6个碱基与UPM两条引物的3’端互补碱基应＜4，NP的5’ 端6个碱基与NUP的3’端的互补碱基应＜4，如果不这样的话，会影响扩增效率，这是因为PCR扩增的关键在3’端的特异性。

但如果是多基因家族的，且已知的信息有限，用RACE的产物可能出现多条带，这不要紧，先将电泳后的胶上的条带转到尼龙膜上，可在EST序列中克隆一DNA片段，用32P-dCTP标记，Southern印迹法，即可鉴定出来。

需要声明的一点是，做RACE的引物与扩增已知序列的引物设计有所不同，5’RACE的GSP和NP引物为cDNA上的序列，3’RACE的GSP和NP引物为与cDNA反向互补的序列。用软件或经验公式提供的退火温度只是一个参考值，在具体操作中要灵活多变。

反转录

5’cDNA的获得：5’CDS　(5'–(T)25N-1N–3'N = A, C, G, or T; N-1 = A, G, or C) 1μl Total RNA 2μl SMART A oligo Ⅱ(5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG–3') 1μl ，ddH2O 1μl 混匀后，稍加离心，EP管用封口膜封好后，浸没于70℃水浴2min，置冰上2min。加入以下药品：5×First-Strand Buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8.3)375 mM KCl 30 mM MgCl2) 2μl ，Power Reverse Tranase (CLONTECH公司)或MMLV　Reverse Tranase 1μl，dNTP(RNase DNase Protase Free) 1μl， DTT(RNase DNase Protase Free) 1μl，混匀后，稍加离心，EP管用封口膜封好后，浸没于42℃水浴90min。加90μl TE Buffer或ddH2O，于72℃水浴7min，以灭活反转录酶。

PCR反应条件的优化　

PCR反应条件的优化，无非是从如下几方面考虑：引物与模板的浓度是否匹配，退火温度是否合适，Mg2+浓度（提高Mg2+浓度，可使引物二聚体的亮度减弱）等等。限于篇幅，不作展开讨论，向大家推荐两个网站(http://www.pebiodocs.com/pebiodocs/00101795.pdf；http://www.qiagen.com/literature/qiagennews/0297/972pcrop.pdf)，其上有详细的说明。

以上是我们结合多种试剂盒的说明书和一些网上查到资料整理成文，并加入了我们在实际操作中行之有效的方法。引物设计，当然，可以用软件，用于 RACE引物设计的原则，是按照我们实验室惯用的方法写成。上面提到的RNA提取的方法经过我们实验室多人的验证，因此，对于高等植物我们认为是比较合适的；但此方法没有在动物和菌类中验证过，其实，对于其它生物RNA的提取可以根据此方法稍加改进，一般来说只要操作得当，应该可以提出高质量的RNA。 PCR反应条件的优化，是建立在引物设计特异性强和高质量的RNA上的，一般来说，前面两个环节没出问题，只要用质量较好的DNA聚合酶，克隆出全长 cDNA志在必得。当然，时代在发展，人类在进步。相信在不远的将来会的更高效、更快捷的方法出现。
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[ Last edited by gene121 on 2007-9-4 at 12:57 ]

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