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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达重组表达载体的连问题
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15376763881

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wxl.1989822 at 2013-03-23 21:40:06
楼主 我和你遇到过相似的情况 不是没有连进去也不是没有切开而是太少了 看不见 pET28a是表达载体 本身克隆数就低 有以下几个解决办法：
1：提质粒的时候多取点菌液，6ml吧
2：酶切的时候多切点，我切的20ul不加水 ...

我有测序的 ，是空载体。除了开头几十个碱基和末尾几十个碱基，其余都是空载体。应该是没有连上。
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11楼2013-03-24 09:30:00
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 15376763881 at 2013-03-24 09:27:20
非常感谢您啊 我这也怀疑是不是一种酶不好用了,因为ecor1不是新买的，上届师姐师兄留下的，xho1是新买的。我也想问的问题就是，如果一个酶切开了而另一个酶没有切开，发生载体自连，像您说的那样会长菌？（我的长了 ...

两个酶单切载体看看，是不是酶的问题
你说的引物问题，不要相信别人，需要你自己去认真地思考，核实
如果出了错误，别人不会为你浪费的时间和精力承担责任

引物设计需要注意的问题，比如，基因内部有没有ecori 和xhoi 位点
有没有保护碱基，是不是能正确的连接到载体上【ORF 问题】
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12楼2013-03-25 10:28:50
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albertw

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

推荐你用同源重组的方法做这个克隆。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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13楼2013-03-25 12:05:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 15376763881 at 2013-03-24 09:27:20
非常感谢您啊 我这也怀疑是不是一种酶不好用了,因为ecor1不是新买的，上届师姐师兄留下的，xho1是新买的。我也想问的问题就是，如果一个酶切开了而另一个酶没有切开，发生载体自连，像您说的那样会长菌？（我的长了 ...

怀疑一个酶有问题的话很容易验证，你只需分别用两个酶做单酶切，看是否能完全切开。
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14楼2013-04-15 00:12:41
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zliaoyuan

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你的xho1引物保护碱基多少个？这个酶效率低，而且要求保护碱基多，如果我没有猜错，是这个原因。要么重新设计酶切位点，要么你先连接到T载体上再切。
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15楼2013-09-24 10:56:51
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