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求经验：水不溶的样品如何能做好反相C18纯化？ 已有1人参与
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最近遇到一个问题和大家讨论下。手头正在做一个项目，样品（暂叫做A吧）在水中几乎一点不溶解，但是据一些渠道了解到，这个在纯化工艺中是有RPHPLC这一步的。等度C18分析柱上主峰保留时间约20min，杂质保留时间约23min。 1. 现在已知A在纯甲醇中溶解度能到400mg/ml，在50%甲醇中溶解度仅为4mg/ml 2. A样在纯DMSO溶解度约为200mg/ml，在50%DMSO中溶解度能到100mg/ml，在25%DMSO中溶解度能到50mg/ml。 3. 在做C18柱纯化时，用20%乙腈-buffer平衡，37%乙腈-buffer等度洗脱约10个柱体积时主峰开始出峰。上样时已经尝试了样品用纯DMSO溶解、25%DMSO-水溶解，上样体积均为0.5ml（柱体积40ml），结果均感觉峰展宽严重，主峰后的杂质分不掉。 针对上述情况，大侠们有什么好的建议吗？碰到这种水不溶样品做反相纯化时大伙是怎么解决的呢？？？ |
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huaqiangliu
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RPHPLC只是一种方法，里面可以装很多种填料 只要是反向的填料都叫RPHPLC，主峰保留时间约20min，杂质保留时间约23min，这个用于分析的话能分开，你制备将其分开一点问题都没有，并且上样量应该还比较大，但是问题我感觉出在你的上样量或者你的制备柱的装填高度上，如果你是半制备那就拉倒了，你改变不了柱子高度，你如果有DAC，那就装的再高点，要么你就用纯甲醇上样少点试一下，流动向改成甲醇低浓度先冲。 再就是我看你这个流动向的配比，你完全可以用反向层析树脂代替C18柱，分开是没有问题的，关键是这个填料可以装填很高，不容易污染。我们原来有个项目就是用的高压制备，向在改为这种树脂了，国产的还便宜1L也就2000左右。 |
2楼2013-03-13 10:07:24
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非常感谢您的回复。关于RPHPLC，我现在正在尝试C18或聚合物基质的反向微球两种填料。至于别的C8、C4基本可以排除。 针对您的回复，有些疑问进一步请教您： 1，“你完全可以用反向层析树脂代替C18柱，分开是没有问题的，关键是这个填料可以装填很高，不容易污染。”这其中说的反向层析树脂是什么？有没有具体的关于厂家、型号、特性等资料介绍？ 2，用纯甲醇溶解进样，会不会造成上样时候峰就展宽？ 另外，这两天的试验我发现一个问题，原来是用20%乙腈-buffer平衡，37%乙腈-buffer等度洗脱。如果改为甲醇-水体系洗脱时，约在65%甲醇-水时出峰。因而我用的是30%甲醇-水平衡的。平衡后在上DMSO溶解的样品时，观察到进样管路中出现浑浊，推测是样品析出了（可能在用乙腈-水体系时也有析出，只是没有观察到），故进一步推测分离度不好的原因会不会是这种析出造成的？ |
3楼2013-03-13 15:31:31
huaqiangliu
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4楼2013-03-14 08:32:48