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木虫 (初入文坛)

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[交流] pcDNA3-XXX质粒扩增与鉴定

2.1. pcDNA3-XXX质粒扩增与鉴定
2.1.1. 试剂配置
LB培养基配方 1000 ml:
胰蛋白胨    10 g
酵母提取物    5 g
NaCl       10 g
加去离子水950 ml用5 mol/l的NaOH调pH 到7.0,灭菌
LB固体培养基（Ampicllin抗性）200 ml
胰蛋白胨    2 g
酵母提取物    1 g
NaCl          2 g
Agarose       3 g
加去离子水180 ml用5 mol/L的NaOH调pH 到7.0,灭菌.
等温度降至55℃左右时，按终浓度5 μg/ml加入氨苄青霉素，混匀，然后在超净工作台中，倒入到灭菌的平皿中，待凝固后，倒扣于4℃冰箱中备用。
TSS buffer 100 ml
PEG 8000 (10%)  10 g
DMSO       5 ml
1M MgCl2    2 ml
LB培养基加到100 ml
然后经过0.2 μm微孔滤膜过滤，－20℃储存备用。
2.1.2. DH5α感受态细胞的制备
1、从含12.5 μg/ml四环素LB培养基的平皿中挑取单克隆菌体接种到5 ml液体培养基中培养过夜。
2、稀释100倍，取0.5 ml菌液50 ml到LB培养基中，37℃振摇
3、2 h后，不断测定培养菌液的OD590值，当光吸收到达0.3－0.5时，取出菌液。
4、菌体用低温离心机2 000 rpm 4℃，10 min。
5、在菌体中加入原有菌液1/40体积的TSS buffer中重悬细胞沉淀物。在冰上进行。分装0.5 ml/管放入液氮速冻，随即放入－70℃保存，即为感受态细胞。
2.1.3. pcDNA3-XXX质粒转化大肠杆菌
1、从国外寄过来的pcDNA3-XXX质粒保存在滤纸片上，用塑料膜密封的。用灭菌的手术剪按环状剪下标记有质粒的部分，放进预加30 μl TE的离心管中，7200 rpm离心1 min，4℃保存。
2、－70℃储存的DH 5α感受态菌种一支放到冰上融化，刚融未融时，加入质粒DNA 10 ng左右，冰浴30 min.
3、42℃水浴，2 min；室温，2 min
4、加上无选择性的LB培养基1 ml,37℃水浴30 - 45 min
5、用200 μl铺氨苄青霉素抗性的固体LB培养基性培养皿, 37℃过夜。
2.1.4. pcDNA3-XXX质粒小量抽提
1、从氨苄青霉素抗性的固体LB培养基性培养皿上挑单克隆到3ml LB（含氨苄青霉素）液体培养基中，37℃，摇床上按225 - 300 rpm，孵育12－14 h。
2、取1.5 ml培养的菌液到1.5 ml离心管，剩下的4℃保存。
3、最大速度（10 000 rpm）离心2 min,弃上清，倒扣于吸水纸上，除去过剩液体，涡旋。
4、加200 μl细胞重悬液buffer P1重悬细胞团,涡旋。
5、加200 μl裂解液buffer P2，上下颠倒4次（足够轻），不涡旋。
6、加200 μl调节液buffer P3，上下颠倒4次（足够轻），不涡旋。
5、最大速度离心10 min,若未成团再离心15min,转移上清到干净的离心管中
6、加0.7倍体积约600 μl×0.7=420 μl异丙醇，低速涡旋混合，低温高速离心,4℃,10min, 弃上清，倒扣于吸水纸上。
7、加入70%乙醇200 μl洗涤，然后离心5 min
8、弃上清，晾干5 min..
9、加50 μl TE buffer 溶解，然后置于4℃保存。
10、酶切鉴定：采用Hind III进行酶切鉴定，按以下顺序加入相应的试剂。设立以下几组：不酶切、Hind III酶切两组，37℃水浴1 h
Table 3. HindIII digest of pcDNA3-XXX
Order 1 2 3 4
Name
ddH2O 10×buffer sample Hind III
Volume 14 μl 2 μl 3 μl 1 μl

11、电泳
采用100 V电压进行电泳，电泳30 min后，在紫外灯下观察，并用Gel-Doc 2000凝胶成像系统拍照。
2.1.5. pcDNA3-XXX质粒大量抽提
1、从小量抽提的阳性培养物中，取100 μl接种到100 ml氨苄青霉素抗性LB培养基中，摇床培养14 h,225 rpm，称为大量培养物。
2、从大量培养物中取700 μl菌液和300 μl甘油（灭菌）加入冻存管，放入-70℃冰箱中保存，并作记录。
3、把100 ml的菌液倒进250 ml离心管中，4℃离心，6 000 g离心15 min（No41 rotor 8 500 rpm）。
4、倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入4 ml 4℃预冷的细胞重悬液buffer P1（预先加入RNase）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。然后将悬浮液转到50 ml的离心管中。
5、加入4 ml细胞裂解液 buffer P2，彻底而且轻柔地颠倒混匀4 - 6次，在室温下孵育不要超过5 min。
6、加入4 ml 预冷的pH调节液buffer P3, 及时而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀）地颠倒混匀4 - 6次，在冰上孵育15 min。再一次混匀样品．20 000 g，4℃离心30 min（N046 rotor 18000 rpm）。
7、在层析柱的顶端加四层纱布，并且用buffer QBT润湿纱布。用4 ml的buffer QBT来平衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。
8、然后把7中的上清小心吸到层析柱中（不可将沉淀绕动），让液体自由流下。
9、用5 ml buffer QC清洗层析柱一次，去掉纱布，再加一次5 ml buffer QC清洗层析柱。
10、用8 - 10 ml buffer QF洗脱DNA,用两只10 ml的离心管分别收集洗脱液。此步可取样20 μl（sample 4）以备检测分析；同时可再加5 ml buffer QF洗柱，洗柱液保存至实验结束（sample 5）以备检测分析，接着按清洗方案洗柱。
11、在两管洗脱液中各加入0.7倍(5×0.7 = 3.5 ml)体积的室温的异丙醇沉淀DNA,并在沉淀会出现的位置做标记，离心前先涡旋，然后在4℃,15 000 g离心30 min(No26 rotor 14 300 rpm),取出时保持平行移动，小心倒去上清。
12、用2 ml室温的70％乙醇清洗沉淀(清洗沉淀盐及置换异丙醇), 4℃,15 000 g离心10 min(No26 rotor 14 300 rpm), 取出时保持管平行移动，小心倒掉上清。注意:不要将沉淀倒掉。
13、在空气中干燥沉淀5 - 10 min,用合适体积的TE（一般500 μl）溶解沉淀。
14、用紫外分光光度计测量提取的质粒的纯度和浓度，并放于4℃中保存。
15、质粒酶切鉴定和电泳，方法同小量抽提。鉴定呈阳性，表明质粒大量扩增成功。

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1楼 2007-08-28 11:40:29

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