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hilib木虫 (初入文坛)
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pcDNA3-XXX质粒扩增与鉴定
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2.1. pcDNA3-XXX质粒扩增与鉴定 2.1.1. 试剂配置 LB培养基配方 1000 ml: 胰蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水950 ml用5 mol/l的NaOH调pH 到7.0,灭菌 LB固体培养基（Ampicllin抗性）200 ml 胰蛋白胨 2 g 酵母提取物 1 g NaCl 2 g Agarose 3 g 加去离子水180 ml用5 mol/L的NaOH调pH 到7.0,灭菌. 等温度降至55℃左右时，按终浓度5 μg/ml加入氨苄青霉素，混匀，然后在超净工作台中，倒入到灭菌的平皿中，待凝固后，倒扣于4℃冰箱中备用。 TSS buffer 100 ml PEG 8000 (10%) 10 g DMSO 5 ml 1M MgCl2 2 ml LB培养基加到100 ml 然后经过0.2 μm微孔滤膜过滤，－20℃储存备用。 2.1.2. DH5α感受态细胞的制备 1、从含12.5 μg/ml四环素LB培养基的平皿中挑取单克隆菌体接种到5 ml液体培养基中培养过夜。 2、稀释100倍，取0.5 ml菌液50 ml到LB培养基中，37℃振摇 3、2 h后，不断测定培养菌液的OD590值，当光吸收到达0.3－0.5时，取出菌液。 4、菌体用低温离心机2 000 rpm 4℃，10 min。 5、在菌体中加入原有菌液1/40体积的TSS buffer中重悬细胞沉淀物。在冰上进行。分装0.5 ml/管放入液氮速冻，随即放入－70℃保存，即为感受态细胞。 2.1.3. pcDNA3-XXX质粒转化大肠杆菌 1、从国外寄过来的pcDNA3-XXX质粒保存在滤纸片上，用塑料膜密封的。用灭菌的手术剪按环状剪下标记有质粒的部分，放进预加30 μl TE的离心管中，7200 rpm离心1 min，4℃保存。 2、－70℃储存的DH 5α感受态菌种一支放到冰上融化，刚融未融时，加入质粒DNA 10 ng左右，冰浴30 min. 3、42℃水浴，2 min；室温，2 min 4、加上无选择性的LB培养基1 ml,37℃水浴30 - 45 min 5、用200 μl铺氨苄青霉素抗性的固体LB培养基性培养皿, 37℃过夜。 2.1.4. pcDNA3-XXX质粒小量抽提 1、从氨苄青霉素抗性的固体LB培养基性培养皿上挑单克隆到3ml LB（含氨苄青霉素）液体培养基中，37℃，摇床上按225 - 300 rpm，孵育12－14 h。 2、取1.5 ml培养的菌液到1.5 ml离心管，剩下的4℃保存。 3、最大速度（10 000 rpm）离心2 min,弃上清，倒扣于吸水纸上，除去过剩液体，涡旋。 4、加200 μl细胞重悬液buffer P1重悬细胞团,涡旋。 5、加200 μl裂解液buffer P2，上下颠倒4次（足够轻），不涡旋。 6、加200 μl调节液buffer P3，上下颠倒4次（足够轻），不涡旋。 5、最大速度离心10 min,若未成团再离心15min,转移上清到干净的离心管中 6、加0.7倍体积约600 μl×0.7=420 μl异丙醇，低速涡旋混合，低温高速离心,4℃,10min, 弃上清，倒扣于吸水纸上。 7、加入70%乙醇200 μl洗涤，然后离心5 min 8、弃上清，晾干5 min.. 9、加50 μl TE buffer 溶解，然后置于4℃保存。 10、酶切鉴定：采用Hind III进行酶切鉴定，按以下顺序加入相应的试剂。设立以下几组：不酶切、Hind III酶切两组，37℃水浴1 h Table 3. HindIII digest of pcDNA3-XXX Order 1 2 3 4 Name ddH2O 10×buffer sample Hind III Volume 14 μl 2 μl 3 μl 1 μl 11、电泳 采用100 V电压进行电泳，电泳30 min后，在紫外灯下观察，并用Gel-Doc 2000凝胶成像系统拍照。 2.1.5. pcDNA3-XXX质粒大量抽提 1、从小量抽提的阳性培养物中，取100 μl接种到100 ml氨苄青霉素抗性LB培养基中，摇床培养14 h,225 rpm，称为大量培养物。 2、从大量培养物中取700 μl菌液和300 μl甘油（灭菌）加入冻存管，放入-70℃冰箱中保存，并作记录。 3、把100 ml的菌液倒进250 ml离心管中，4℃离心，6 000 g离心15 min（No41 rotor 8 500 rpm）。 4、倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入4 ml 4℃预冷的细胞重悬液buffer P1（预先加入RNase）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。然后将悬浮液转到50 ml的离心管中。 5、加入4 ml细胞裂解液 buffer P2，彻底而且轻柔地颠倒混匀4 - 6次，在室温下孵育不要超过5 min。 6、加入4 ml 预冷的pH调节液buffer P3, 及时而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀）地颠倒混匀4 - 6次，在冰上孵育15 min。再一次混匀样品．20 000 g，4℃离心30 min（N046 rotor 18000 rpm）。 7、在层析柱的顶端加四层纱布，并且用buffer QBT润湿纱布。用4 ml的buffer QBT来平衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。 8、然后把7中的上清小心吸到层析柱中（不可将沉淀绕动），让液体自由流下。 9、用5 ml buffer QC清洗层析柱一次，去掉纱布，再加一次5 ml buffer QC清洗层析柱。 10、用8 - 10 ml buffer QF洗脱DNA,用两只10 ml的离心管分别收集洗脱液。此步可取样20 μl（sample 4）以备检测分析；同时可再加5 ml buffer QF洗柱，洗柱液保存至实验结束（sample 5）以备检测分析，接着按清洗方案洗柱。 11、在两管洗脱液中各加入0.7倍(5×0.7 = 3.5 ml)体积的室温的异丙醇沉淀DNA,并在沉淀会出现的位置做标记，离心前先涡旋，然后在4℃,15 000 g离心30 min(No26 rotor 14 300 rpm),取出时保持平行移动，小心倒去上清。 12、用2 ml室温的70％乙醇清洗沉淀(清洗沉淀盐及置换异丙醇), 4℃,15 000 g离心10 min(No26 rotor 14 300 rpm), 取出时保持管平行移动，小心倒掉上清。注意:不要将沉淀倒掉。 13、在空气中干燥沉淀5 - 10 min,用合适体积的TE（一般500 μl）溶解沉淀。 14、用紫外分光光度计测量提取的质粒的纯度和浓度，并放于4℃中保存。 15、质粒酶切鉴定和电泳，方法同小量抽提。鉴定呈阳性，表明质粒大量扩增成功。 |
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