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njml

金虫 (小有名气)

[求助] 引物间Tm相差16度,如何设置退火温度

做PCR,一条引物Tm为76.55,另一条为60.26,做了梯度PCR,退火温度在50和56.8时均出现目的条带,但非特异扩增产物较多,降低模板量又没东西了.请问象这种Tm相差比较大的引物如何进行PCR?

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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)

Tm相差这么大,换个引物试试,一般相差在4度以内比较好!
另外我怀疑你的Tm值计算有误,你是不是计算了酶切位点的?!
优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
2楼2007-08-23 08:28:18
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jiasanlin

金虫 (小有名气)

你试一试现在高Tm的引物条件下跑5个循环后,然后在低的Tm条件下跑我这样试过一个差10度的引物对。
3楼2007-08-23 11:13:07
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zhangyuyue2006

金虫 (正式写手)

你做一个降落pcr看可以不
4楼2007-08-23 11:24:48
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njml

金虫 (小有名气)

昨天用65度循环5次,然后50度循环25次,还是没有目的带,有一200bp以下的非特异产物和引物二聚体.今天再降低温度试试.
5楼2007-08-24 13:44:11
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