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遥控器68

金虫 (小有名气)

[求助] 公司制备的短肽抗体小样下周到手，一周内要测试小样情况，我需要做些什么准备

如题，去年十一期间选的序列让制备了短肽抗体，三个半月过去了，刚公司技术上说下周ok，要送来小样试用下，再决定是否送大样。
    有经验的亲们请帮忙给说说我都要做些什么准备来试用小样吧。
1.公司送小样抗体时候邮寄的东西一般包括什么？二抗还要再买么，会附送有么？
2.送来后怎样进行测试？需要电转和wb，那是否要做抗体浓度梯度，还是直接用大浓度？
3.怎样才算测试合格？
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1楼 2013-01-11 17:01:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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遥控器68: 金币+3, ★有帮助 2013-01-12 13:02:56
一般送小样的时候还会给你pre-bleed。你需要做一个简单的western，用野生型或者你有过表达株的蛋白样，最好能有knockout株作为负对照。分别用他给你的小样和pre-bleed做一抗。不同稀释比例当然最好做，不过可以先用比较浓的，如1:1000, 如果有特异的带在小样prob的blot上而不在pre-bleed prob的blot上，分子量大小与目标蛋白差不多的话就差不多可以确定了。确定抗体工作后再优化稀释比例，测定线性工作范围。
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3楼2013-01-12 07:41:33
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nlbtr

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-11 21:13:06
遥控器68: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-01-12 13:04:56
1，一般就是定制的抗体，二抗很普遍啊，一般实验室都会有，当然你让人家送，人家有，也应该送，这个不值钱；
2，提您的目的蛋白，如果您的目的蛋白在野生型里，本身有表达，那么就不要再转啦，直接体蛋白做WB，如果没有表达，你之前的细胞裂解液没留点么？不行就要再做瞬转了；
3，WB是否出条带，条带是否是对的位置，杂带多不多，是否影响观察。
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2楼2013-01-11 17:23:45
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