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mollyzhang

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[交流] Vemurafenib：首个获批的抗BRAF突变肿瘤药已有1人参与

摘要：驱动型原癌基因的识别提供了重要的、可以改变整个肿瘤治疗蓝图的药物靶标。其中一个例子就是BRAF原癌基因，它存在于大约半数黑色素瘤中，也存在于其他几种肿瘤中。作为一个可以作为靶标的激酶，BRAF成为了小分子药物研发中非常重要的一个靶点。随着一系列快速临床研发流程的实现，vemurafenib（Zelboraf；Plexxikon/Roche）于2011年8月用于治疗BRAF突变型转移性黑色素瘤在美国获批，并在2012年2月在欧盟也获得批准。本篇综述主要描述以下几方面：BRAF的潜在生物性、用于筛选识别vemurafenib的技术手段、它的临床研发过程以及从它的研发过程中所吸取到的经验。

RAF丝氨酸/苏氨酸激酶是重要的信号集合因子，他们的起始成员RAF是作为一个病毒性原癌基因大约在30年前被发现的。作为一个原癌基因，RAF参与了肿瘤细胞的增殖过程。对于人源同系物CRAF的克隆，使得人类基因组中另外两个同系物ARAF和BRAF被发现。就像接下来所描述的，RAF激酶家族在生长因子信号通路中占据重要的地位（图16）。

图16 RAF通路。生长因子通常与酪氨酸激酶受体（RTK）结合，RTK通过自磷酸化（用Y-P标识）来激活下游信号通路，包括RAS，RAF，ERK和MAPK/ERK激酶MEK。RAF激酶活性启动一系列激酶级联反应，同过直接磷酸化MEK，从而磷酸化ERK，ERK进入核内，从而改变基因表达。在其被发现的多年后，RAF才被证明为RAS的下游因子。RAS通过GDP结合形式与GTP结合形式的转化来调控多种效应子。RAS-GTP与RAF直接结合的发现导致了人们发现了膜结合RAS-GTP募集RAF上膜，从而产生激活效应激酶。同很多别的激酶一样，RAF家族成员通过二聚化、磷酸化和非磷酸化调控。BRAF-BRAF和CRAF-CRAF二聚体以及BRAF-CRAF异二聚体都已被证明。ERK等下游信号的反馈磷酸化调节可以部分地去二聚化。
在2002年，研究发现BRAF在很多不同类型肿瘤中都发生了突变，这使得人们对于BRAF的功能理解前进了一大步。尤其是，大多数突变都发生在同一个密码子中，即密码子600，最典型的是由谷氨酸代替了缬氨酸（V600E突变）。这一密码子处于BRAF的活性环中，这一环状结构被发现在大多数激酶中都用于调控激酶活性，而突变（通常为V600E）的发生可以最终促进激酶活性，从而驱动肿瘤细胞增殖。并且这一突变在大约半数的黑素瘤中以及其他许多肿瘤类型中出现。
虽然BRAF已经成为了一个抗肿瘤靶点，但是RAF激酶多年都无法产生结晶结构，阻碍了特异性化合物的识别。随着对RAF家族的焦点转向BRAF，以及sorafenib这个相对可能的抑制剂的出现，在2004年，首个晶体结构终于问世。就像下面要提到的，结构信息对于vemurafenib的发现非常重要。
这里我们将描述发现vemurafenib的方法论，以及对于最终导致其获批用于BRAF突变型转移性黑色素瘤治疗的临床前和临床数据。
Scaffold为基础的激酶抑制剂研发
激酶抑制剂是整个20世纪80和90年代，大多数大型制药公司的研发重点。到21世纪初为止，传统的利用高通量筛选大型化合物库方法已发现了几种抑制激酶活性的化合物类型，例如喹唑啉类、氨基嘧啶、羟吲哚、二芳基脲类。但是，这其中并没有理想的活性用以抑制BRAF。Plexxikon公司探寻一种能够识别针对激酶的新scaffolds（实际上是任何想要的有晶体结构的蛋白家族）的开发途径，从而探寻新的化学空间以及新的结合形式。研究者应用这一scaffold为基础的方法识别了新的激酶抑制剂。这一方法筛选了具有选择性化学特性的小分子化合物，来最大化样品的化学空间，从而得到了20000个化合物。然后应用生化试剂盒来读取大量的动力学信号数据，再下一步应用共结晶的方法。通过激酶与化合物的共结晶结构可以清楚地找到真正结合的化合物，从而新的化合物类型被识别。根据这些结构信息，化学家、计算化学家以及结构生物学家们可以筛选出最佳的化合物前体，从而合理地进行改造。
为了构建一个针对BRAF的稳定表达结晶系统，研究者设计了一个缩短的高溶解性的激酶片段。利用这一方法，确定了超过100个与BRAF结合的化合物的共结晶结构。通过反复修饰，在一年的时间里，就发现了vemurafenib和PLX4720（一种在啮齿类中有更好药代动力学的姐妹药）。这两个化合物具有最佳的结合力、选择性和药代动力学特征。
Vemurafenib的生物学特性
Vemurafenib在2005年早期首次合成。虽然，在生化试验中，相对于野生型BRAF，它对于BRAF的V600E突变型的选择性不显著，但是，在黑色素瘤或者是结直肠癌细胞系试验中，它对于突变型的选择性是非常显著的。这一显著的细胞水平上的选择性，可能部分地由BRAF突变细胞对MEK（MAPK/ERK 激酶，也叫MAPKK）抑制剂的高特异性来解释。研究表明，如果BRAF是增殖的驱动因子，那么MAPK信号通路就对于细胞增殖非常重要。虽然vemurafenib和MEK抑制剂都抑制细胞增殖，但是它们的药效动力学并不相同。MEK抑制剂无细胞差异地抑制ERK磷酸化，而vemurafenib仅抑制BRAF突变细胞的ERK磷酸化。
虽然vemurafenib对于不同组织来源的细胞系具有显著差异，但是，vemurafenib对于BRAF600密码子突变的细胞具有显著的影响。从而，BRAF V600E黑色素瘤、结直肠癌和甲状腺乳头状癌细胞系的增殖均可以被vemurafenib抑制。
当在体外实验中对vemurafenib敏感的BRAF突变细胞系被异体移植到体内后，这些移植体仍然对于口服vemurafenib敏感。我们选择了一个适度敏感的带有 BRAFV600E突变的COLO205结直肠癌细胞系，来模拟典型的人类肿瘤探索vemurafenib药理学特征。如图17所示，当这些细胞被用于异体移植模型时，随着vemurafenib口服剂量的增加，最初引起肿瘤停滞（~100μM•小时），随后引起肿瘤衰减（~300μM•小时及以上）。

图17异体移植模型中的vemurafenib试验。BRAFV600E突变人源结直肠癌细胞系在免疫缺陷小鼠的侧腹部生长。当肿瘤体积达到150mm3的时候，利用填喂法进行4星期3种vemurafenib浓度或者对照组口服给药。出现了明显的浓度依赖性肿瘤生长抑制，进行了药代动力学评估，图表中给出了第7天的AUC曲线下面积。在300 μM•小时出现肿瘤衰退，这一结果确定了一个临床前药物利用阈值，用以指导临床试验。
Vemurafenib结合的结构分析
共结晶化研究可以实现对于vemurafenib结合的分析研究。Vemurafenib与BRAFV600E突变蛋白的共结晶化研究表明BRAF形成二聚体。共结晶化在vemurafenib的发现过程中发挥重要的作用，使得以“锚定生长”为原则的scaffold为基础的方法应用于药物设计。“锚定生长”方法使得特异性结合突变型原癌基因的新一代激酶抑制剂产生，并且引进了一种新的激酶抑制剂类型作为工具化合物。
临床药理学
在最初的临床试验开始前，要先研究一种诊断试剂，用以识别拥有BRAF原癌基因的黑色素瘤（见BOX1）。
一旦vemurafenib由于它的有利潜能、选择性和药学特性被选为临床研发候选药物，那么接踵而来的是一系列临床前研究，用以指导预测它在人体的安全性和药代动力学。基于这些成功的毒性和安全药理学研究，一项《新药研发申请》于2006年秋天被FDA存档。几乎同时，Plexxikon公司和罗氏签署了一项合作协议，共同进行vemurafenib的临床研究。
重构研究。Vemurafenib最初的形式是胶囊式结晶粉末（并且添加几种常用的药物佐剂来稳定结构，提高生物利用度），可以通过口服给药。这虽然适用于最初的临床测试，但是不利于制造和贮存，同时晶体结构证明，最高溶解度不稳定。为了提高溶解度和稳定性，罗氏将vemurafenib重制入一种称为微沉淀散装粉（microprecipitated bulk powder）的非结晶材料。基于一项健康受试者的药代动力学研究，微沉淀散装粉制剂被证明，相对于晶体形式，在生物利用度上有6倍的增长。
I期剂量扩大试验。剂量扩大I期安全性试验(ClinicalTrials.gov identifier: NCT00405587)最初是用晶体粉末在一些学术医院的实体肿瘤患者身上使用。由图18所示，药代动力学研究表明，在最初形式的药物利用中，患者血药浓度达到~200μM•小时的平衡水平，这远低于临床前肿瘤衰减的浓度阈值300μM•小时。但是，重构的vemurafenib使得剂量增加试验重新启动，起始剂量为原晶体形式剂量水平的十分之一（也就是160mg，每天两次）。一共6个临床试验中心在招募富集患者群体，尤其是双组织样（也就是，用药前和用药中的样品）都可以获得的患者。由于对于新剂型药品的延展性非常有信心，研究者当时预测下一剂量水平240mg 每天两次可以达到300μM•小时的阈值，从而在BRAF突变主导肿瘤生长的患者体内首次看到肿瘤衰减。结果证明我们是正确的（图18），从而提供了一个非常漂亮的转化科学实例，由生化抑制，通过细胞水平到异体移植模型指导临床试验。

图18 在人血浆中vemurafenib利用度的药代动力学分析。a.最初的晶体形式是的药物利用度达到了饱和。使得新剂型药物迫在眉睫。在临床前得到的300 μM•小时的肿瘤缩小剂量Y由虚线表示。b. vemurafenib重制后血药浓度提高了六倍，并且没有明显的饱和现象。AUC：曲线下区域。
临床有效性和安全性
黑色素瘤患者临床试验。Plexxikon公司研究者与临床研究者确定I期临床试验中有很大的机会为转移性黑色素瘤患者提供良好的临床治疗。所以，公司招募了32个患者进行黑色素瘤扩展试验，以960mg 每天两次的剂量（ClinicalTrials.gov identifier: NCT00405587）。达到了空前的81%的未证实总体应答率，而且，在肿瘤应答时间和延长总体存活率方面，960mg 每天两次服药的患者与BRAF野生型患者或者是服用辅助治疗剂量的患者相比，其优势都是非常喜人的。基于这些，Plexxikon公司和罗氏的研究者都自信地认为可以开始随机临床III期试验，以及一个临床II期试验和其他I期试验研究。
黑色素瘤临床II期试验的应答结果
临床II期试验的目标是在更多的拥有BRAF突变激活并且经过多种治疗的黑色素瘤患者身上试验vemurafenib的有效性和安全性（ClinicalTrials.gov identifier: NCT00949702）。一共招募了132名患者，包括10名BRAFV600K突变患者（其余为BRAFV600E突变患者，见BOX1）。一项独立检查评估的结果显示，确认的总体应答率为53%，包括6%的完全应答。应答时间中值为6.7个月。
有趣的是，一些临床应答是在患者服用vemurafenib大于6个月是被记录。最重要的是，随着这些患者被追踪超过一年后，总体存活的中值为15.9个月，这与之前在转移性黑色瘤患者的6~10个月相比具有很明显地优势。
关键的临床III期试验
关键性III期试验是针对大群体（675名患者）、随机的、严格控制的试验，用以评估vemurafenib作为单治疗药物，与达卡巴嗪相比，作用于不可切除的IIIc或IV期未经治疗的黑色素瘤患者（都是BRAFV600E突变阳性）的有效性和安全性（ClinicalTrials.gov identifier: NCT01006980）。
为了最少化患者对于对照组达卡巴嗪的应用，FDA建议III期统计分析计划修订为假定vemurafenib有更大的临床优势。临床III期试验数据分析显示，与达卡巴嗪组相比，vemurafenib组患者在存活时间上具有临床上和统计学上的显著提高（P <0.0001），并且在死亡率上也有63%的降低（风险比: 0.37）。
临床药效学
在临床I期试验中，一部分黑色素瘤患者有成对活组织样品：一个是首次vemurafenib之前的样品，一个是用药14天后的样品。这些样品通过检测ERK磷酸化来看BRAF通路，同时进行Ki67增殖染色和PET成像。所有可评估患者的应答都记录在册，并且显著应答的案例在图19中显示。结果显示：肿瘤衰减需要接近全部的此信号通路的抑制。初次试验是研究100mg•小时剂量下的药代动力学，如图17，这一剂量下肿瘤处于停滞期，起初我们非常鼓舞地发现14天给药后，pERK和Ki67染色有大于50%的降低，但是，并没有出现肿瘤衰减，无恶化存活与对照组相比也基本没有差异。

图 19 服用vemurafenib患者的PET成像。PET成像可视化观察18F-脱氧葡萄糖的摄取。a和b为两个患者，左侧为开始治疗前，右侧为用药2周后。PET结果显示，vemurafenib给药后肿瘤代谢明显阻滞。
但是，利用重构的vemurafenib后大大提高了利用率。从这些更高利用率患者样品中达到的数据结果相当喜人：pERK和Ki67染色有大于80%的降低。图20将肿瘤衰减比作pERK和Ki67染色的药效终点降低。与更高的利用度和随后的通路抑制相一致，在肿瘤暴露于这些更高的药物剂量后，频繁地出现了肿瘤衰减。

图20 临床I期的成对活组织样品数据。来自于I期试验的患者成对活组织样品分析。一个样品为给药前的，一个为给药2周后的。进行pERK和Ki67的免疫组化染色。Y轴表示的是这两个标记物的抑制百分比，x轴表示的是vemurafenib的血浆水平。图表显示，即使是药物浓度不到300 μM•小时的患者，这两项指标的抑制率也>50%，篮圈内的患者是没有出现肿瘤衰减的。插图显示了一个代表性的案例，一名患者在用药14天后出现了54%的肿瘤缩减，其染色结果如图。
由BRAF抑制剂揭露的RAF新生物特性
随着这些具有前景的临床结果的公布，Plexxikon公司的化合物对学术研究者们开放，从而可以开始更细致地研究BRAF抑制的重要作用。这些学术研究包括：探索BRAF突变肿瘤中的抑制机理和描述vemurafenib耐受的机理。他们也研究在BRAF突变缺乏的细胞中RAF抑制的效用。在过去的两年中，超过200篇描述vemurafenib药效的文章被发表。
许多实验室已经验证了vemurafenib选择性地抑制多个BRAF突变的黑色素瘤、甲状腺癌和结直肠癌细胞系中MAPK信号通路。对增殖的抑制和对凋亡的诱导在细胞系间具有相当大差异。
耐受机理。由于黑色素瘤细胞系对于vemurafenib的敏感度有很大差异，固有耐受的原因在某些研究中被提到。通过PTEN的缺失而引起的PI3K通路的激活发挥重要的作用，但并不能总是很好的预测vemurafenib的药物敏感性。还有除了MAPK和PI3K通路之外的因子参与其中。其中一个因子已经被识别：通过眼癌蛋白肿瘤抑制子的细胞周期调控。
最近，在BRAFV600E结直肠癌中发现了一个固有耐受的重要原因：EGFR的激活。因此vemurafenib和EGFR拮抗剂的联合应用提供了一个BRAF突变结直肠癌治疗的新方案。
大多数黑色素瘤患者在vemurafenib治疗期间会有一些程度的肿瘤衰减，但是通常在一年内就会复发。这暗示，BRAF抑制会出现获得性耐受，很多不同的机理被阐述。可能首个被提议的机理就包括CRAF的表达。
在大量临床前和临床试验中被记录的第二个机理就包括NRAS的激活，NRAS是RAS原癌基因的同系物，并在一些原代黑色素瘤中被发现。而且，通过例如PDGFR和IGF1R等生长因子受体的上调也被提到。BRAF的扩增也可能发生，这一机理也用以解释MEK抑制剂耐受。最近研究中还提到了HGF和其受体MET也参与vemurafenib的耐药性。
MAPK激活的机理。由于vemurafenib的临床成功性，在2010年，对于MAPK通路激活的矛盾机理在一系列文章中被提到。这些研究显示，MAPK通路的激活需要上游生长因子通路的激活或者是RAS突变。如今，已普遍认为，RAF酶的二聚化是上游信号通路活化的决定因素。
未来方向
Vemurafenib的研发史充满了启示、成功和希望。但是，虽然有显著的肿瘤衰减和无恶化生存率和总生存数上的增加，但如今，只有非常少的转移性黑色素瘤患者被vemurafenib治愈。BRAF抑制，尤其是vemurafenib对于BRAF的抑制，给转移性黑色素瘤患者提供了非常重要的治疗选择。其中应该被探索的想法是，在非晚期黑色素瘤患者身上进行vemurafenib的试验，或者是辅助试验。此外，也期望进行其他BRAF突变肿瘤类型的研究以及与其他治疗进行联合应用。
基于之前进行的耐药性机理研究以及BRAF突变肿瘤的基本生物特性，许多不同的组合策略被推荐。由于MAPK通路经常在复发肿瘤中被重新激活，一个vemurafenib和MEK抑制剂的联合用药被批准，并且此类的研究也正在进行。此外，黑色素瘤和其他肿瘤对于PI3K通路的共依赖也建议我们将vemurafenib与PI3K、AKT或者mTOR的抑制剂联合用药。
并且与其他的临床试验相比，由vemurafenib研发中获得的知识可以开拓用于下一代BRAF抑制剂的研发。
总的来说，我们相信vemurafenib的发现和研发过程可以给将来的个性化药物提供处方。其中材料包括：一个驱动癌基因，一个可以识别癌基因患者的诊断方法；一个可以特异地有效地抑制这一癌基因功能的药物。未来的预想是：癌症首先被驱动基因注解，然后一个针对这些关键驱动的药物组合药方被研发出来，从而治疗患者。
BOX1 BRAF诊断发展
认识到了准确识别携带BRAF黑色素瘤患者的重要性，Plexxikon公司于2005年与罗氏分子系统合作（vemurafenib临床试验开始前一年）。
为了获得一个稳定可再生的试剂盒，要克服多重困难。首先，福尔马林固定石蜡包埋的组织样品（FFPET）可以很好地保存不同质量和年龄的组织，也可以保存DNA聚合酶的内生性抑制剂，这可能干扰结果。尤其对于黑色素瘤样品，内源性的黑色素成为了一个障碍。因此，提取FFPET中的DNA需要相当大的最优化。PCR试剂的产生以及PCR分析的配置和最优化都需要足够的资源。而且，FFPET样品由临床试验地点（或者是患者最初诊断的诊所）向分析实验室的运输问题，以及及时的与临床研究员交流结果，都面临高度的时间敏感性考虑。
罗氏分子系统的科学家们发展了一种实时PCR分析来检测BRAFV600E突变型。这种分析可以直接检测FFPET中的BRAF突变。这一技术包括一对互补的引物来扩增V600密码子周围的BRAF序列，以及两个荧光标记的探针。一个探针识别野生型DNA序列GTG，另一个识别突变型DNA序列GAG；每一个探针由不同的荧光标记。探针包括一个荧光标记和一个淬灭剂。如果探针与DNA序列正确地结合，则PCR聚合酶的核酸酶活性可以切断淬灭剂，从而保持亲和探针的荧光强度。由于野生型和突变型的探针在同一个试剂中，每个检测反应都需要一个同进程对照。
BRAF试剂盒也有分析性能。输入125ng包括5%突变的基因组DNA（由5 μm FFPET中获得）可以产生>96%的命中率。它的特异性和敏感度远远高于传统的测序。有趣的是，虽然这一试剂盒设计用于特异性地检测V600E突变型，它也会偶然地检测V600K或者是更稀有的V600D突变型。
诊断试剂的研发基本与vemurafenib的临床研发同步。
随着原型诊断试剂盒与临床I期试验同步研发，这一试剂盒被用作临床II期和III期的注册标准。进入临床II期和III期的样本也使得这一诊断试剂盒获得批准。从BRAF试剂盒中获得的数据与传统的Sanger测序相比较，有差异的数据进行更为敏感的深度测序分析（即454测序）。综合数据在2011年5月提交到US监管当局，这一诊断试剂盒在2011年8月获得了市场批准，与vemurafenib的批准同期获得。
宋巧玲编译吴慧校译自
《Vemurafenib: the first drug approved for BRAF-mutant cancer》

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