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询问PCR 退火温度
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请问退火温度设计的原理是什么呢？ 两端引物取平均吗？有没有明确的原理呢？ |
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2楼2007-07-26 00:12:29
★
johnsooh(金币+1):thanks
johnsooh(金币+1):thanks
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引物的重要参数是熔解温度（Tm）。 当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。 计算Tm 有几种公式。第一个公式(Wallace 规则):Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T）,这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于15-20个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式(Baldino 算法)适用于计算14-70个核苷酸在≤0.4mol\L 的阳离子溶液中的Tm, 也可用于扩增产物的Tm 计算.Tm=81.5+16.6*lg[K+]+0.41(%[G+C])-(675/n)。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm 可能差异不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一样的，所以确定引物Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序如Primer5 等均使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 |
3楼2007-07-26 06:35:02
tangling37
木虫 (小有名气)
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4楼2007-07-26 08:38:03