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hjz021824

银虫 (正式写手)

[求助] pcr

pcr 反应体系10*buffer 5.0ul，2.0mmol/l dNTP 4.0ul,上游引物2.0ul，下游引物2.0ul  1u/ul Taq酶 2.0ul 基因组模板2.0ul ,ddH2O 27ul
反应程序 95度 预热5分钟
3  95   1min  59  1min  72  1min30s
3  95    1min  58  1min  72  1min30s
3  95   1min   57   1min   72  1min30s
3   95  1min   55   1min   72  1min30s
25  95  1min  52   1min   72   1min30s
     72   30min
     这是木聚糖的pcr  我已经p了三次  电泳的时候只出现比mark超前的条带 老师说那不是基因组  大家帮我看下上面的程序哪里有问题
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什么时候才能让自己不再那么卑微
1楼 2012-12-15 15:10:24
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从buffer的量看是50ul，总体积不对。引物和基因组浓度没有。如果只出现比marker快的条带，可能是引物二聚体。如果模板用量正确的话，PCR产物中是看不到的。如果能看到是用太多了。此外，目的条带是多大的？延伸时间是根据扩增片段长度来的。Taq酶是1min/kb。还有就是最后延伸30分钟是是不是太长了？
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3楼2012-12-16 01:31:00
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j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的buffer里面有镁离子没得嘛，模板浓度是多大？总体积也不对啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2012-12-16 12:15:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

先按照正确体积再做一次。引物浓度还是没弄清楚。一般引物的终浓度是100uM-1mM，你自己去计算一下。
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8楼2012-12-17 06:21:23
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gdj363702043

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Mg2+呢？    不行换mix   Hi要加引物、模板和mix就行  而且跑胶的时候连buffer都不用加了
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加油努力
10楼2012-12-17 13:56:56
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gdj363702043

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

buffer  没有  MG2+    现在大多数都用mix你可以查一下  这个是所有东西都有   误差小   东洋纺的就行   你查一下就知道了   PCR用的
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加油努力
12楼2012-12-17 17:56:33
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gdj363702043

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看说明书   有中文版的
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加油努力
14楼2012-12-18 07:55:50
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼上的建议都是不错的，我再指出一条，Taq酶量太大，1u/ul的酶加1ul就足够了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
15楼2012-12-18 11:32:21
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你做PCR可以买生物公司合成的Mix，里面含有buffer、NTP、镁离子、溴酚蓝等，很好用，跑PCR产物是有指示，我们实验室一直在用，很方便！
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18楼2012-12-18 17:29:28
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普通回帖

shuishui007

木虫 (小有名气)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2012-12-18 11:24:29
一般PCR 25ul体系也就够了，你的体系好象是50ul，但总体积又不是50ul.。引物也没有浓度，模板也不知加了多大的量（ng)，实在不知道你是怎么做的。PCR产物怎么会是基因组？好象是新手，原理还没搞懂，建议还是请教师兄师姐用个标准程序扩吧。
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2楼2012-12-15 22:27:11
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hjz021824

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by j2 at 2012-12-16 12:15:34
你的buffer里面有镁离子没得嘛，模板浓度是多大？总体积也不对啊

有镁离子，模板稀释了十倍，总体积好像没有50 少加了6ul水有影响吗
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什么时候才能让自己不再那么卑微
5楼2012-12-16 12:21:09
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hjz021824

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shuishui007 at 2012-12-15 22:27:11
一般PCR 25ul体系也就够了，你的体系好象是50ul，但总体积又不是50ul.。引物也没有浓度，模板也不知加了多大的量（ng)，实在不知道你是怎么做的。PCR产物怎么会是基因组？好象是新手，原理还没搞懂，建议还是请教师 ...

呵呵，以前从来没做过，我的是宏基因组，从腐布中提取的，好像是水少加了6ul，引物是根据mw/33得到再加水稀释的，模板直接加水稀释十倍。
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什么时候才能让自己不再那么卑微
6楼2012-12-16 12:26:57
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hjz021824

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-16 01:31:00
从buffer的量看是50ul，总体积不对。引物和基因组浓度没有。如果只出现比marker快的条带，可能是引物二聚体。如果模板用量正确的话，PCR产物中是看不到的。如果能看到是用太多了。此外，目的条带是多大的？延伸时间 ...

总体积是不对，少加了水，那个是宏基因组，我也不知道目的条带多少，引申时间一般多大？
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什么时候才能让自己不再那么卑微
7楼2012-12-16 12:30:19
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hjz021824

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-17 06:21:23
先按照正确体积再做一次。引物浓度还是没弄清楚。一般引物的终浓度是100uM-1mM，你自己去计算一下。

好的，谢谢你哦！
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什么时候才能让自己不再那么卑微
9楼2012-12-17 11:52:35
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