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minrui0522铁杆木虫 (小有名气)
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求助:蛋白酶酶活的测定方法
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| 请问谁知道蛋白酶酶活测定的具体方法和步骤?我需要具体的实验步骤!知道的,请回复.万分感谢. |
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wanghongyu776
木虫 (小有名气)
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一般是以酪蛋白和干酪素或BAEE为底物检测蛋白酶活性。 本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物. N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。 胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。 本实验方法二采用以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活性。以酪蛋白为底物，主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯醋酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内，酶的水解滤液在波长275nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收作对照，根据活力单位的定义，确定样品中胰蛋白酶的活性。活力单位的定义：在一定条件下，每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1μmol酪氨酸在275nm 处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。 方法和步骤] 1、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）测定法： 取2个光程为1cm的带盖石英比色杯，分别加入25℃预热过的2.8mL 1.0mmol/L BAEE底物溶液。向一个比色杯内加入0.2mL10mmol/L HCl，作为空白，在波长253nm下调节仪器零点；向另一个比色杯中加入0.2mL待测酶液，立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min。测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之间为宜。若偏离此范围则要适当增减酶量。 以时间（t）为横坐标，光吸收值（ A253nm）为纵坐标作图，在直线部分任选一个时间间隔与相应的光吸收值变化（△A253nm），按以下公式计算胰蛋白酶的活力单位。 2、酪蛋白为底物测定法 （1）取3支试管，1～3编号。 取试管1，加入1.0mL 酶液，加用0.1mol/L、pH8.0硼酸盐缓冲液2.0mL，在水浴保温10min，精确加入40℃预热的10mg/mL酪蛋白溶液5.0mL，混匀，立即置于40℃水浴中，准确反应30min后，加入5.0mL的5%三氯乙酸，迅速摇匀。 取试管2，加入1.0mL 酶液，加用0.1mol/L，pH8.0硼酸盐缓冲液2.0mL，在40℃水浴保温10min，精确加入5.0mL 5%三氯乙酸，摇匀，在40℃水浴保温30min后，再加10mg/mL酪蛋白溶液5.0mL，混匀。 取试管3，分别加入5.0mL 5%三氯乙酸和8.0mL 0.1mol/L（pH8.0）硼酸缓冲液，混合。 将上述三试管溶液于3 500r/min离心10min，分别取上清液。 以试管3离心上清液作参比，在紫外分光光度计中波长275nm处测定试管1和试管2离心上清液的光吸收值（A275）。 （1）酪氨酸对照液的测定 以0.2mol/L盐酸溶液作参比，在波长275nm处测定酪氨酸对照溶液的光吸收值（AS）。 [结果计算] 式中 A —— 试管1测得的光吸收值； A0 —— 试管2测得的光吸收值； AS ——酪氨酸对照溶液的光吸收值； C对照 ——酪氨酸的浓度（μg/ mL）； M对照 ——酪氨酸的分子量（181.19）； V总 ——反应总体积（mL）； V样品 ——加入的样液体积（mL）； t ——反应时间（min）； n——样品的稀释倍数。 |
6楼2008-04-15 11:32:17
glucidum
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2楼2007-07-20 08:05:26
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