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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★
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thinkerboy: 回帖置顶 2012-12-05 18:05:13
1949stone: MolEPI+1, 果然是神 2012-12-05 19:41:57
thinkerboy: 金币+2 2012-12-12 13:31:29

你这个应该做简并引物PCR，而且比对不是比对的是DNA序列，而是比对是的氨基酸序列，找出保守序列，然后再设计简并引物。

具体步骤如下：

一、利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关氨基酸序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个NCBI蛋白数据库中查找与之相似的氨基酸序列，并保存所有搜索到的序列。

二、对所找到的序列进行多序列比对
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线分析http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。其结果如下图所示, 所有序列的共有部分将会显示出来。“*” 表示保守，“：” 表示次保守。

三、确定合适的保守区域
设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，从而使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。

四、利用软件设计引物
当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差一个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T），该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。