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aixuejun00银虫 (小有名气)
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结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段(二)
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三 分枝杆菌快速培养检查 分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。由于应用营养丰富的液体培养基，并且检测仪能连续监测，故提高了从标本中分离分枝杆菌的敏感性进而缩短报告结果的时间。为保证检查方法的可靠性，目前分枝杆菌快速培养检查系统除提供相应仪器、试剂以外，均根据系统制定了相应的临床标本前处理方法、接种、检测和报告结果的检查规程，故在进行相应的检查时，结果的重复性和可比性均能得到认可。 在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的去污染处理，必须严格按照系统说明书中给定的方法进行。孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳性报告。 四 分枝杆菌药物敏感性测定法 （一）培养基 1、基础培养基：无淀粉改良罗氏培养基 成分： 谷氨酸钠（纯度99%以上） 7.2g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.4g 硫酸镁（MgSO4 7H2O） 0.24g 柠檬酸镁 0.6g 丙三醇 12ml 蒸馏水 600ml 新鲜全卵液 1000ml 2%孔雀绿水溶液 20ml 注：无机盐试剂应采用化学纯（CP）以上等级的试剂。 2、抗结核药物溶液的配制和稀释： （1） 药敏试验用抗结核药物应从厂家取得纯品，并确认纯度和效价，在有效期内使用。 （2） 异烟肼（INH）、利福平（RFP）、氨硫脲（TB1）、乙硫异烟胺（TH）、环丝氨酸（SC）的生物效价按其重量单位计算，均为1000μg/mg，计算用药量时只需考虑其纯度。链霉素硫酸盐（SM-SO4）、乙胺丁醇盐酸盐（EMB-CL）、卡那霉素硫酸盐（KM-SO4）、卷曲霉素硫酸盐（CPM-SO4）、紫霉素硫酸盐（VM-SO4）、对氨柳酸钠盐（PAS-Na）等在考虑其纯度的同时，应按生产厂家标定的毫克效价计算其盐型用量。 （3） 每种药物按表1所示制成高浓度药液，在按相应比例稀释成低浓度药液。 （4） 除RFP、TB1、TH用二甲基甲酰胺溶解，再用灭菌蒸馏水稀释外，其他药物可用灭菌蒸馏水溶解、稀释。 3、含药培养基制备： （1） 每100 ml基础培养基加入1 ml配制、稀释好的抗结核药液，混匀，无菌分装7ml/管，85℃凝固50分钟。 （2） 制成的培养基37℃无菌试验24小时，检查培养基污染情况后置4℃避光保存，1个月内使用。 （二）绝对浓度法间接法：是我国三十多年来一直沿用的常规药敏试验方法 1、菌悬液制备： （1） 临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无需二次传代即可做药敏试验，初生长2周后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上二次传代，取2-3周的亚培养物进行试验。 （2） 取上述培养物（需刮取斜面各个部分的培养物）放玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动使呈乳酪样，以0.5%吐温-80生理盐水磨菌稀释，与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）比浊，即配成1mg/ml的菌悬液。 2、接种：将1mg/ml的菌悬液10倍稀释至10-2 mg/ml，以灭菌吸管准确吸取菌液0.1ml分别接种于含药培养基和对照培养基斜面上，每管接种菌量为10-3 mg。置37℃培养四周观察结果。 3、 结果报告方式： 按下列方式报告对照及含药培养基上菌落生长情况： 分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长 分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的¼ 分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2 分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4 分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面 培养基斜面上菌落数少于20个时，报告菌落数。 4、质量控制：每批试验应以结核分枝杆菌参考菌株（H37Rv敏感株） 10-3 mg检测含药培养基质量。接种10-3 mg要求对照培养基菌落数在200个以上且无融合，若菌落数低于50个时，要求重新作药敏试验。 （三）比例法：是世界卫生组织（WHO）全球结核病耐药监测项目统一推荐的方法。 1、 培养基制备：同上述绝对浓度法。培养基药物中药物终浓度为：异烟肼0.2mg/ml，双氢链霉素4mg/ml，利福平40mg/ml，乙胺丁醇2mg/ml。 2、 菌液：新鲜菌落制成1.0mg/ml菌悬液，依次稀释至10-2和10-4 mg/ml。 3、 接种：分别接种10-2和10-4 mg/ml菌液0.01ml至对照及含药培养基斜面。 4、 培养：37℃培养4周 5、 结果的判读、解释和报告：计算耐药百分比，即含药培养基上菌落数与无药培养基上菌落数相比的百分比。小于1%报告敏感，大于或等于1%报告耐药。 五 分枝杆菌菌种鉴定 （一）分枝杆菌微生物学概述 目前报道的分枝杆菌种类已有100余种。在微生物分类中，分枝杆菌划归放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。 在结核病流行病学研究和临床诊断检验中，通常将分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群(TB complex)和非结核分枝杆菌(Nuntuberculosis Mycobacterium, NTM) 。结核分枝杆菌复合群包括四种分枝杆菌：结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、牛分枝杆菌(M. bovis)、非洲分枝杆菌(M. africanum)和田鼠分枝杆菌(M. microti)；临床上最常见的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。 根据“伯杰细菌”(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th Edition)，将分枝杆菌菌种基本上分为两大类：一是在营养丰富的培养基内，在适宜的温度条件下，接种很少的细菌分离物，孵育7天以内肉眼可见单个菌落者为快速生长分枝杆菌；超过7天的则为缓慢生长分枝杆菌。缓慢生长分枝杆菌根据其色素产生的情况，又进一步分为光产色、暗产色和不产色三组。 （二）分枝杆菌菌种鉴定的实验流程 1、经抗酸染色镜检确定是抗酸菌的培养阳性菌株，必须首先接种改良罗氏（L-J）培养基进行增菌传代。 2、进行分枝杆菌菌种鉴定，首先经对硝基苯甲酸 (PN生长试验、28℃生长试验、耐热触酶试验、观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM。 3、 鉴定试验确定属于结核分枝杆菌复合群的菌株，需进行TCH生长试验、硝酸还原试验和烟酸试验进行菌种鉴定。 4、 于NTM的菌株，首先根据生长速度的快慢确定属于快速生长还是缓慢生长的分枝杆菌。快速生长的分枝杆菌可通过生长特征和生化实验进行菌种鉴定；缓慢生长的分枝杆菌经色素产生试验确定菌株的产色特征后，再通过生长特征和生化试验确定菌株的种类。 （三）分枝杆菌菌群鉴定试验 分枝杆菌菌群鉴定的目的既是鉴定菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM，也是进行进一步菌种鉴定的基础。 分枝杆菌菌群主要通过菌株在含对硝基苯甲酸(PN的鉴别培养基上的生长情况、28℃生长情况、生长速度、耐热触酶试验及观察菌株的菌落形态、颜色等生物特征来进行区分。通过上述试验，可将需要鉴定的菌株划归结核分枝杆菌复合群或NTM菌群。 （四）结核分枝杆菌复合群菌种鉴定试验 目前临床分离鉴定属于结核分枝杆菌菌群的菌株，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌占绝大多数。这两种分枝杆菌，需要同时采用下列实验进行鉴别区分：噻吩－2－羧酸肼(TCH)培养基生长、硝酸还原试验、烟酸试验。 （五）NTM菌群生长特征鉴定试验 经菌群鉴定试验被划归为NTM菌群的分枝杆菌，如需进一步进行菌种鉴定，应首先进行生长特征鉴定试验。相关试验主要目的是观察分枝杆菌的生长速度、色素产生情况、菌落形态特征、在各种鉴别培养基上生长情况的结果，包括：苦味酸培养基生长试验、5%NaCl培养基生长试验、谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基生长试验、麦康凯琼脂培养基生长试验等。 （六）NTM菌种鉴定常用生化特征试验 经菌群鉴定试验被划归为NTM菌群的分枝杆菌，在进行生长特征鉴定试验的同时，还应进行常用的生长特征鉴定试验，以进一步鉴定到种水平，相关的试验包括：吐温－80(Tween-80)水解试验、尿素酶试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收试验、亚碲酸盐还原试验等。 （七）分枝杆菌菌种鉴定试验的质量控制 所有进行菌种(菌群)鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为3～4周且生长良好；所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限；所有标明有对照的鉴别实验，在实施时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果；进行相应实验时，应采取必要措施，注意防止菌株对操作人员、实验室和社会环境造成危害和污染。 六 结核分枝杆菌聚合酶链(PCR)反应检查 作为分子生物学实验手段之一的PCR方法，由于其敏感性高、特异性强和反应迅速等特点，已广泛应用在生物和医学研究领域；近年随着其技术的不断完善和改进，也逐步应用于医学、特别是对病原微生物的临床检查方面。 （一）PCR检查在结核病临床诊断中的作用 由于目前的结核分枝杆菌PCR检测商业试剂盒，基本上都仅针对一个(或几个)结核分枝杆菌特异性基因靶序列进行扩增检测；而影响PCR检测结果的诸多因素，在一个试剂盒的检测体系中不能够完全被消除；另外，结核分枝杆菌PCR检测结果与结核病临床诊治及流行病学的符合性尚待进一步证实。因此，目前临床标本结核分枝杆菌的PCR检测结果，在结核病的临床诊治中，只能够作为辅助参考，不能作为结核病诊断的主要指标。临床医师在参考结核分枝杆菌PCR检查的同时，必须同时参照结核分枝杆菌的传统微生物学检查(包括抗酸染色镜检、特别是分枝杆菌培养检查) 的结果并参考其它临床检查手段所得到的结果进行综合判断。 （二）临床标本结核分枝杆菌PCR检测试剂盒概述 根据我国临床生物诊断试剂的规定，用于临床标本结核分枝杆菌PCR检测的试剂盒，必须具有国家药品监督管理局颁发的生产文号。 目前，我国已颁发生产文号的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒，按照其扩增和检测原理，可分为两大类：一类是扩增产物经杂交后利用ELISA工作原理进行检测，此类试剂盒中都应具有防止扩增产物污染的试剂和相关操作步骤；另一类采用荧光物质标记的引物或探针在扩增管中直接进行扩增和检测，由于此类试剂盒一般使用特殊扩增仪、在相对封闭的环境中连续完成扩增和检测过程，故一部分此类试剂盒中可能没有防止扩增产物污染的试剂和相应操作步骤。 （三）临床标本结核分枝杆菌PCR检测实验步骤 由于目前获批准生产并上市的临床标本结核分枝杆菌PCR检测试剂盒的种类较多，故检测实验必须严格按照选定的试剂盒生产厂家提供的使用说明和操作步骤完成相应检测并判断结果。 （四）结核分枝杆菌PCR检测的质量控制 由于PCR实验方法的特点，进行PCR检测实验的实验室必须建立并遵守相应质量控制规章制度。相应规章制度应至少包括下列内容： 1、 完成PCR检测实验的操作人员必须经过专门培训。 2、 PCR检测实验室必须制定处理有害试剂和预防污染的条例，并根据实验过程划分工作内容相对单一的操作区域。 3、 必须选用具备国家药品监督管理局颁发生产文号的检测试剂盒；同时生产厂商提供操作的技术培训和指导。 4、 使用的试剂盒必须在有效期内；检测实验记录中必须包括试剂盒的生产批号。 5、 进行检测的相应标本必须符合试剂盒说明书中列举的种类和质量标准。 6、 每次实验必须设立阴性、阳性和空白对照；严格按照试剂盒说明书提供的操作步骤完成检测实验，如果相应对照样本检测结果出现问题，必须进行重新实验并分析记录引起问题的可能原因。 7、 对于结果检测值处于无效区和灰区的样本必须进行全过程的重复检测并根据重复检测值报告结果。 8、 检测实验使用后的废弃物、废弃试剂必须按照操作区域分别集中，并经121℃、30分钟蒸汽灭菌后方可丢弃。 9、 测实验使用的各种仪器必须符合相应规定。 七 结核病免疫学辅助诊断检查 作为因病原微生物感染所造成的人体疾病之一，在临床上利用免疫学实验技术检查机体对分枝杆菌、特别是结核分枝杆菌感染造成的免疫反应，从而帮助临床医师进行鉴别诊断，有一定的实际意义；但由于结核分枝杆菌的生物特性及此类病原菌引起的人体免疫反应较为特殊和复杂，截止到目前为止，结核病的免疫学检查在临床诊断中的作用尚存有较大争议。 因此，目前结核病免疫学的检测结果，在结核病的临床诊治中，只能够作为辅助参考，不能作为结核病诊断和评价治疗效果的指标。临床医师在参考免疫学检查结果的同时，必须同时参照结核分枝杆菌的传统微生物学检查(包括抗酸染色镜检、特别是分枝杆菌培养检查) 的结果并参考其它临床检查手段所得到的结果进行综合判断。 （一）结核病免疫学检查试剂盒概述 根据我国临床生物诊断试剂的规定，用于结核病免疫学检查的试剂盒，必须具有国家药品监督管理局颁发的生产文号。 目前，我国已颁发生产文号的结核病免疫学检测试剂盒，按照相应的实验步骤，可分为两大类：一类试剂盒检测的标本一般为血清，是利用ELISA实验原理进行检测，此类试剂盒中都应具有相应的阴性、阳性和空白对照试剂；另一类试剂盒采用快速金标法进行检测实验，检测的标本有血清和全血，此类试剂盒均应具备显示反应正常的质控线或斑点。 由于结核病免疫学检查的试剂盒种类及相应实验步骤区别较大，故请开展此项检查工作的实验室严格按照选用试剂盒厂家提供的说明书进行实验、判断和报告结果。 （二）结核病免疫学检查试剂盒实验的质量控制 1、 完成结核病免疫学检查实验的操作人员必须经过专门培训。 2、 必须选用具备国家药品监督管理局颁发生产文号的检测试剂盒；同时生产厂商提供操作的技术培训和指导。 3、 使用的试剂盒必须在有效期内；检测实验记录中必须包括试剂盒的生产批号。 4、 进行检测的相应标本必须符合试剂盒说明书中列举的种类和质量标准。 5、 采用ELISA技术完成检测的试剂盒，每次实验必须设立阴性、阳性和空白对照；严格按照试剂盒说明书提供的操作步骤完成检测实验，如果相应对照样本检测结果出现问题，必须进行重新实验并分析记录引起问题的可能原因。 6、 采用快速金标方法完成检测实验的试剂盒，每批试剂盒投入正常使用前，相应实验室应使用检测结果已知为阳性、阴性的标本或使用生产厂家提供的对照预先进行检测，检测结果相符后方可投入正常使用。 7、 对于结果检测值处于无效区和灰区的样本必须进行全过程的重复检测并根据重复检测值报告结果。 八 结语 本文归纳了结核病细菌学检验所包括的4项基本技术（涂片染色镜检、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定）以及结核杆菌临床基因扩增（PCR）检验技术、分枝杆菌快速培养及药物敏感性试验技术、免疫学有关检测技术的国家规范。结核病实验室检查，特别是细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。虽然这些常规检查方法在技术上比较成熟，但笔者认为尚存在以下几个问题： 1、 结核病诊断方法，目前只是在结核病防治系统内初步得到规范和质量控制，但结核病最初的诊断约85%是在综合性医院里，而恰恰是在综合性医院里结核病的细菌学诊断尚不够规范且水平参差不齐，所以加强和提高综合性医院的结核病细菌学诊断水平是我们今后工作的重点之一。 2、 结核病的诊断技术目前还处在较低的水平，国际推荐的涂片和培养方法也还分别存在着特异性差、敏感性低和结果报出时间太长的不足，因此不断加强结核病诊断新技术的研究和开发仍然是十分必须的。结核菌的快速培养系统是一项得到国际认可的结核菌检测技术，大大提高了培养结果的报出时间，但由于仪器设备昂贵，检测成本太高而较难推广普及。敏感、特异、快速、经济、个体化是今后结核病实验室诊断的发展方向。 鉴于结核病实验室检查、特别是细菌学检查在结核病控制工作中的重要性，为保障相应检查项目结果的可靠性，要求相应的检查项目必须由经过培训并考核合格的专职人员完成，且开展相应检查的实验室应具备安全操作设施并制定实验室内部质量控制措施，同时接受专业结核病参比实验室的质量控制督导和培训。 |
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