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结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段
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结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。以显微镜查痰发现涂阳病人为主的方法发现病人是世界卫生组织最近推行的现代结核病控制策略（DOTS）中的五大要素之一。痰涂片镜检和培养是全球公认的结核病诊断的基本的和标准的方法。 我国50多年来，一直沿用和不断改进结核菌的细菌学涂片、培养、药敏实验和菌型鉴定方法，1998年以后，逐步在方法学方面与世界卫生组织在全球推荐的方法相统一，使我国的结核病诊断结果做到国际可比。几年来我国结核病防治系统的细菌学实验室在结核病诊断方面的标准化和规范化方面作了大量的工作，制定了技术标准和质量控制系统，促进了结核病诊断水平的规范和提高。 目前许多结核病实验室已经在细菌学检验的基础上引入了免疫学和分子生物学检测技术对结核病进行多种技术方法的联合检测，如细菌学与免疫学检测方法或分子生物学检测方法联合应用，将单一细菌学检测的灵敏度由原来的30-50%提高到70-90%，大大提高了结核菌的阳性检出率。 但免疫学和分子生物学检测技术，虽然诊断的灵敏度和检测时间等方面比原有方法有了很大进步，但同时也存在成本高、操作复杂、技术要求高难以标准化规范化并且检测特异性及结果解释等方面的问题也需要进一步进行考核、验证。 本文将就涂片镜检、分离培养、药敏试验、菌种鉴定等结核病细菌学常用诊断方法及其规范化操作加以归纳总结。 一 痰涂片检查法 （一）玻片的准备 取经95%乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻璃片，于玻片背面的左端1/3处用玻璃笔编号。一张玻片只能够涂抹一份痰标本，每张玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于抗酸染色检查。 （二）直接涂片法 用接种环或专用竹签挑取标本的脓样、干酪样部分约0.05-0.1 ml，于玻片正面的右侧2/3中央处均匀涂抹成1×2 cm椭圆形痰膜，自然干燥。 （三）集菌涂片法 1、 漂浮集菌法：取深咳痰或12－24h痰液经121℃高压灭菌15min，待冷后，取5～10ml盛于体积为100ml的玻璃容器中（口径约2cm），加灭菌蒸馏水20～30ml，总体积勿超过容器的1／3，加二甲苯0．3ml，放振荡器振荡10min，取出，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的载物玻片盖于瓶口上，静置20min，取下载玻片，自然干燥，火焰固定，染色镜检。 2、 离心集菌法：取深咳痰或12－24小时痰液经121℃高压灭菌15min，待冷后，取5～10ml盛于体积为500ml的离心管中，加水至50ml，经6000-8000rpm离心20分钟后，取沉淀涂片检查。 （四）萋尔-尼尔逊氏抗酸染色法 1、染色液： 染色剂——0.8%石碳酸复红溶液 脱色剂——5％盐酸乙醇液 复染剂——0.6‰亚甲蓝溶液 2、染色步骤： （1） 涂片自然干燥后，火焰固定。 （2） 滴加复红染色剂盖满痰膜，小心火焰加热，出现蒸汽后脱离火焰，保持染色3分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。 （3） 流水自玻片背面上端轻洗，洗去染色液。 （4） 自痰膜上端外缘滴加脱色剂，流过痰膜，需脱至痰膜无可视红色为止。脱色应单片进行。 （5） 流水自玻片背面上端轻洗，洗去脱色液。 （6） 滴加亚甲蓝复染剂，染色30秒钟。 （7） 流水自玻片背面上端轻洗，洗去复染液。 （8） 待干后镜检。 （五）镜检与报告 1、 用双目光学显微镜（目镜10×，油镜100×）镜检，在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。 2、 按照下列标准报告镜检结果： 抗酸杆菌阴性（－）：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。 抗酸杆菌可疑（±）：1-8条抗酸杆菌/300视野。 抗酸杆菌阳性（1＋）：3-9条抗酸杆菌/100视野。 抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野。 抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。 抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野。 （六）废弃标本和污染物的处理 痰盒和废弃标本等污染物，均需经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。痰盒等污染物如采用焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚烧不彻底或暴露焚烧是有害的。痰检工作面的消毒：可将痰标本置于一搪瓷盘中，在操作橱内进行痰涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物等一并进行高压蒸汽灭菌，或与操作台面同时以3％石炭酸或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外线灭菌灯（距离≤1米）照射30min。 二 分枝杆菌分离培养检查法 （一）培养基：分离培养基采用酸性改良罗氏培养基。 1、成分： 谷氨酸钠（纯度99%以上） 7.2g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 14.0g 硫酸镁（MgSO4 7H2O） 0.24g 柠檬酸镁 0.6g 丙三醇 12ml 马铃薯淀粉 30g 蒸馏水 600 ml 新鲜全卵液 1000ml 2%孔雀绿水溶液 20ml 注1：无机盐试剂应采用化学纯（CP）以上等级的试剂。 注2：WHO在“结核病控制实验室工作手册（1998）”中建议分离培养使用无淀粉改良罗氏培养基。 2、制备方法： （1） 基础液制备：量取蒸馏水600 ml，加入各无机盐成分、谷氨酸钠和丙三醇，溶解后加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴1小时使呈糊状（不时摇动，防凝块），冷却。 （2） 新鲜鸡卵液制备：洗净新鲜鸡卵表面，浸泡在70%乙醇或其他稀释消毒液中20-30分钟。取出，擦干，开口，收集鸡卵液，搅匀。通过消毒的纱布过滤成鸡卵液 （3） 将600 ml基础液和1000 ml新鲜鸡卵液混匀。加入2%孔雀绿水溶液20 ml，混匀，静置1小时后，分装至标准螺旋盖培养管或灭菌中试管中, 每管7ml。 （4） 双层放置于搁架中，经培养基蒸汽凝固灭菌器 85℃凝固灭菌50分钟。培养基斜面应占试管的2/3。 （5） 制成的培养基应斜面鲜艳，表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。 （6） 制成的培养基37℃无菌试验24小时，检查培养基污染情况后置4℃避光保存，1个月内使用。 （二）痰标本去污染处理 视标本性状，加1-2倍体积4%氢氧化钠（NaOH）消化液于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋振荡器上振荡1 分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15-20分钟。样本数较多时，应分批处理。 （三）接种和培养 用吸管取去污染后的标本0.1ml, 均匀接种在整个培养基斜面，每份标本接种2只酸性罗氏培养基。接种后斜面向上于37℃环境中平放24小时后，检查培养基污染情况，拧紧瓶盖，直立放置，37℃继续培养。 （四）结果报告 1、 接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况。发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长分枝杆菌阳性。此后每周观察一次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告分枝杆菌生长。培养阴性结果须在满8周后未见菌落生长者方可报告。 2、 观察时发现非分枝杆菌生长时，应报告污染。培养污染率应在2-5%范围内。污染率过高，提示培养基灭菌不佳，标本前处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。 3、培养结果报告方式： 分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长 分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的¼ 分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2 分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4 分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面 分枝杆菌培养阴性应以“培养阴性”报告，不得以“－”表示。菌落生长不足斜面面积¼者，报实际菌落数。 |
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