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【原创】猕猴桃叶多糖及其硫酸化产物的光谱学分析【已搜无重复】
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目前关于猕猴桃多糖的研究报道较多，但多局限于多糖提取工艺问题的讨论，很少对其构效关系作深入探讨。事实上，多糖的一级结构和高级结构与其生物活性间的构效关系是当前糖化学和糖生物学共同关注的焦点问题。 1材料与方法 1.1材料 中华猕猴桃的叶子，。自然晾干，低温粉碎，备用。 1.2试剂 正丁醇、三氯甲烷、苯酚、复合蛋白酶、吡啶、氯磺酸、甲酰胺、95%乙醇、无水乙醇、氢氧化钠、氯化钡、硫酸铰、明胶、三氯乙酸、硫酸钠、盐酸、硝酸、二甲基甲酰胺、氘代水、溴化钾等均为分析纯。 1.3仪器 2.6cm×100cm玻璃层析柱，上海亚荣生化仪器厂；RE52CS旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；BSZ-100自动部分收集器，上海精科有限公司；UV-240型紫外分光光度计，日本岛津；WATERS2690高效液相色谱仪，美国WATERS公司；Nexus670傅里叶变换红外光谱仪，美国Nicolet公司；BickerADVANCE DM×500超导核磁共振仪，德国Biuker公司。 1.4实验方法 1.4.1猕猴桃多糖的分离纯化 1.4.1.1粗多糖的提取 将适量粉末按蒸馏水：干粉（质量比）=50：1浸溶，95℃水浴中浸提12h后，冷却至40℃，加入1％质量的复合蛋白酶，调pH至5.5保持2h, 95℃水浴保持1h,16层纱布抽滤，收集滤液；滤渣加入20倍体积蒸馏水，95℃浸提6h,16层纱布抽滤，合并两次滤液；50℃下真空旋转蒸发浓缩溶液至原来体积的1/10, 4000/min离心15min,自来水透析48h,蒸馏水透析24 h,除去色素和小分子无机物，按95%乙醇：溶液=6：1把提取液倒入95%乙醇中，静置1 h,取出絮状粗多糖，用乙醚与乙醇交替冲洗3次，重新用双蒸水溶解，再倒入6倍体积的95%乙醇，真空冷冻干燥得灰白色猕猴桃粗多糖。 1.4.1.2 Sevage法去蛋白[4]：真空冷冻干燥得去蛋白质的猕猴桃多糖。 1.4.1.3 Sephadex G-200柱层析纯化 以Sephadex G-200凝胶为固定相，双蒸水为流动相，2.6×100cm玻璃柱为层析柱，操作压力为14cm水柱，l0min/管,3mL/管，自动部分收集器收集200管。以硫酸-苯酚法490nm处隔管测定吸光度，绘制吸收峰，合并处于最大吸收峰处的分离液，旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥得到白色的猕猴桃纯多糖。 1.4.2猕猴桃多糖的硫酸化：Wolfrom法[5]。 酯化试剂制备：加无水吡啶于500mL圆底烧瓶中，冰水浴冷却至0℃,磁搅拌下缓慢地加入氯磺酸，室温下持续搅拌30min,密封后冰箱中冷藏，1周内有效。 猕猴桃多糖硫酸酯的合成：猕猴桃多糖粉末悬浮于甲酰胺中，磁搅拌下滴加酯化试剂，反应结束后，冰水浴中冷却至0℃，加入已预先冷却至0℃的4mol/LNaOH溶液中和溶液，离心，透析，真空旋转蒸发浓缩后加入3倍体积的95%乙醇，离心，干燥得到白色的猕猴桃多糖硫酸酯。 1.4.3猕猴桃多糖硫酸酯中硫含量的测定[6] 样品加入4mol/LHCI 100℃水解6h,蒸干后加入8%的三氯乙酸溶液，使游离的硫酸根离子与钡离子在明胶溶液中形成混浊，于360nm处测定浊度，用硫酸钠为标准物作标准曲线，计算得硫含量。 1.4.4紫外光谱分析 将猕猴桃多糖溶液在200-400 nm处扫描。 1.4.5高效液相色谱分析条件 标准多糖为T-葡聚糖系列，色谱柱为μ-Bondagel E-liner和μ-Bondagel E-125,洗脱剂为pH 6.8、1 mol/L磷酸盐缓冲液，检测器为Waters-996数据处理，数据处理软件为Waters-Millennium 32。 1.4.6红外光谱分析 猕猴桃多糖及其硫酸化产物用KBr压片后测定。 1.4.7 13C NMR核磁共振分析 猕猴桃多糖及其硫酸酯分别溶于D2O，用500MHz核磁仪扫描。 2结果与讨论 2.1猕猴桃多糖理化性质鉴定 2.1.1猕猴桃多糖的纯度鉴定 猕猴桃多糖水溶液经紫外分光仪在200-400nm区间扫描后没有明显的特征吸收峰，表明多糖中不含核酸和蛋白质。 2.1.2猕猴桃多糖的组分鉴定和分子质量测定(图1) 高效液相色谱图显示只在15-18min之间有一峰，并测得分子质量为3.42×105Da，表明猕猴桃多糖纯化后得到的组分均一。 图1 猕猴桃叶多糖的高效液相色谱图 Fig.1 HPLC Chromatograph of polysaccharide from Chinensis actinidia leaf 2.1.3猕猴桃多糖的红外光谱分析(图2) 红外光谱图显示：3423cm－1处的宽峰在3600-3200 cm－1之间，表示有O-H的伸缩振动；在3000-2800 cm－1之间，2924 cm－1处的弱吸收是C-H的特征峰；1384 cm－1处的峰在1 400-l200 cm－1之间，则是C-H的变角振动；而1634 cm－1处的峰是C=O键的吸收峰，以上各峰都是多糖的特征吸收峰。 1038 cm－1处的强吸收峰是吡喃糖环的醚键 图2猕猴桃叶多糖的红外光谱图 Fig.2 Infrared spectrum of polysaccharide from Chinensis actinidia leaf 2. 2猕猴桃多糖硫酸化的结果与结构分析 2.2.2红外结果分析 硫酸化衍生物的红外光谱图与猕猴桃多糖红外图谱图比较，图谱中都出现了1240 cm－1左右的S=O伸缩振动和810cm－1左右的C-O-S伸缩振动的特征吸收峰，说明硫酸根已经与猕猴桃多糖分子结合成酯。同时，多糖的特征峰依然存在，但由于受到硫酸根的影响，其它基团的特征峰都偏离了原来的位置，表明猕猴桃多糖分子在得到修饰的同时，其主体结构未被破坏[7]。 图3 硫酸化多糖的红外光谱图 Fig.3 Infrared spectrum of sulfated Chromatograph of polysaccharide 223 13C NMR法确定硫酸基取代的位置 图4和图5是猕猴桃多糖和硫酸化多糖的13C NMR谱图。对比两者，由于图4中在79×10－6－86×10－6之间没有出峰，可知C-2,C-3,C-6上的羟基未被取代。86.517×10－6和87.736×10－6是β(1→3)键中C-3的化学位移。图4中62.052×10－6处是多糖中C-6的峰，在其硫酸酯的图谱中却没有相应的峰，但是在68.609×10－6处出现了一强峰，这是由于C-6上的羟基被取代，其化学位移移向低场的结果，因此硫酸基的取代位置在C-6上。此现象可能与多糖的三级结构有关。 图4猕猴桃叶多糖的13C NMR谱 Fig.4 13C NMR spectrum of sulfated Chromatograph of polysaccharide 图5硫酸化猕猴桃叶多糖的13C NMR图 Fig.5 13C NMR spectrum of sulfated Chromatograph of polysaccharide 3结论 猕猴桃叶粉末经过水提、醇析、Sevage法去蛋白处理，最后经Sephadex G-200凝胶柱层析纯化后，得到组分均一的、分子质量为3.42×105Da的猕猴桃叶多糖。红外光谱显示猕猴桃多糖的分子结构为吡喃型β-D-葡聚糖。 用Wolfrom法对猕猴桃多糖分子进行硫酸化改性。产物经红外光谱检测后，证明硫酸基与猕猴桃多糖结合成酯。 分别对多糖和经Wolfrom法得到的多糖硫酸酯进行13C NMR法分析后，确定了硫酸基的取代位置，即在葡萄糖残基的C-6位置上，其原因可能与猕猴桃多糖的三级结构有关，对此还需进一步的研究。 [ Last edited by calledone on 2007-10-16 at 00:02 ] |
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