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用于荧光原位杂交的石蜡切片预处理方法
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FISH操作前为石蜡包埋组织切片推荐的预处理程序 试剂： 2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane， Sigma)、丙酮、二甲苯、酸性亚硫酸钠（sodium bisulfite ）、蛋白酶K、2XSSC、0.1M HCl、70%乙醇、85％乙醇、100％乙醇 预处理程序： 1. 将载玻片浸入2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane， Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 丙酮溶液中5分钟，随后在丙酮及蒸馏水中漂洗，自然干燥载玻片。 2. 从福尔马林固定石蜡包埋组织中获取多块4微米切片，分别置于以上经氨基烷基硅烷（aminoalkylsilane）处理过的载玻片上。 3. 将组织切片置于65℃下过夜烘烤。 4. 将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100%乙醇中5分钟。 5. 将组织切片依次室温置于100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各两分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水中3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分。 6. 50℃下用30%[w/v] 酸性亚硫酸钠（sodium bisulfite ）处理组织切片20－30分钟。 7. 于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟 8. 取0.4ml蛋白酶K储存液（20mg/ml）溶于40ml 20XSSC(pH 7.0)得到蛋白酶K工作液（200µg/ml）；将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育20-30分钟。 9. 组织切片经蛋白酶K消化后，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。 特别说明：为确保消化充分，可以自然干燥组织切片，将15µl DAPI复染剂滴加于组织切片区域，立即盖上盖玻片。暗处放置10-20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察消化情况。如果消化过度，可放弃本次FISH实验，选择新的组织切片重复实验，缩短蛋白酶K消化时间；如果消化不充分，可将组织切片浸泡在2XSSC溶液中帮助脱落盖玻片，盖玻片脱落后，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟，然后将组织切片置于37℃蛋白酶K工作液中继续消化5-20分钟；如果消化适中，可将组织切片浸泡在2XSSC溶液中帮助脱落盖玻片，盖玻片脱落后，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟，继续第9步实验操作。 10. 将组织切片置于0.1M HCl中室温浸泡5-10分钟，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。 11. 将组织切片玻片依次置于-20℃预冷的70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水。 12. 将组织切片室温浸入丙酮溶液中2分钟。 13. 自然干燥玻片。 14. 加热玻片至56℃。 15. 按照FISH操作步骤进行FISH实验。 |
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