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添翼如虎

新虫 (小有名气)

[交流] 测序送样已有6人参与

我们已经将DNA片段连接到T载体上,并做完克隆,请问要测插入的DNA序列是直接送菌液呢还是再用菌跑PCR的产物呢?谢谢各位关注
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sxxuan

金虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
直接送菌液,或者是提取质粒之后送测序。如果送PCR后再测序,可能出现错配之类的,并不能100%真实反映菌液中重组质粒的序列。可以用T载体上的通用引物测序
如果为了省时间,金唯智的测序是直接用菌液测序而不是提取质粒的。其他公司是不是这样就不确定。如果只是送菌液不考虑时间的话,哪个公司都差不多,现在一般3天就可以拿到测序结果。
你的日子如何,你的力量也必如何!
7楼2012-11-20 09:45:40
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sxxuan

金虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by 添翼如虎 at 2012-11-20 10:21:29
我用之前的引物重新扩增了一下菌液,发现条带和以前一样,这样能说明是阳性克隆吗?有的文献上用EcoR1做了酶切来确定阳性克隆,这个酶切是干什么的?...

酶切是确定载体上真的连接了目的序列,因为PCR是有很多假阳性的。
如果经费不限的话,可以挑几个阳性的送测序。如果不行的话,要提取质粒,做酶切之后跑胶看看有没有目的片段。
至于选什么酶切位点,可以看看载体上的酶切位点,再看看目的序列上有没有相应的,如果没有才可以用。
不过我一般都不切,送测序才20块一个反应,提质粒酶切跑胶的成本都不止了。
你的日子如何,你的力量也必如何!
11楼2012-11-20 11:25:47
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