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wei_suzhen新虫 (小有名气)
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用感受细胞转化
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用氯化钙制备的大肠感受细胞，然后转化，在转化的过程中，目的基因与感受态混合时，能否用枪头抽打混匀？用焼烫过得玻璃棒涂布时，怎么判断玻璃棒已经冷却了？有没有哪个童鞋遇到过，用热的玻璃棒涂布把菌全部都烫死啦的情况？ 用相同的感受态细胞、相同的氨苄、相同培养基，一个下午做，一个晚上做的。师姐转化的平板长菌斑啦，为什么我做一个都没长？ 离心的转速、摇菌的时间会影响转化吗 |
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Renavatio
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11楼2012-11-19 21:21:20
cicelyzh
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【答案】应助回帖
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zhang8826857: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-19 15:10:45
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DNA与感受态细胞混合最好不要用枪头打，把管子缓慢倒过来自然混匀比较好。涂布的玻璃棒要充分冷却，否则会把菌烫死的。现在很多实验室都是用一次性的塑料棒涂布了。你可以把玻璃棒烧热后计时冷却，然后试试温度。就可以知道要等多久冷好。 此外，你的转化没长有可能是操作问题，也有可能是克隆连接没做好。你是否同时做了正对照？ |
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wei_suzhen2楼2012-11-18 15:36:50
kingleo99
木虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
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目的基因与感受态混合千万不能吹打，轻轻的弹弹就可以了，因为水分子的震动就会使得质粒与感受态细胞相结合，你吹打的厉害第一会造成质粒断裂，第二造成感受态细胞破裂，感受态细胞此时的状态时一种细胞壁被撑开的状态，你吹打会造成细胞膜破裂使得内容物流出来，细胞就死掉了。 玻璃棒在烧热后等一会，你可以使用以下两中降温的方法，1）将玻璃棒放在平板的盖子内侧，然后你咋外隔着玻璃感受下玻璃棒是否还是热的，这样也可以使得你的玻璃棒上温度降低，2）可以将玻璃棒轻轻放在培养基边缘看是否能够融化培养基上的琼脂，如果琼脂快速的有那种烫的印子那就得等等。 转化没长原因很多的1）你的感受态细胞活力不够，比如你转化前有一步是将感受态和质粒混合放置半小时，如果你的感受态细胞是绝大部分均匀悬浮的那么就是你的感受态活力很高，如果基本都沉到地下了那么活力就不够，如果活力不够可以尝试让细菌稍稍延长20分钟的复苏2）涂布也有一定的关系，感受态涂布只需要轻轻的刮上三四下千万别想着要把它涂布干了，平板要是太湿了没关系只需要轻轻的几下就行了平着放在室温或者温箱1个小时后再倒着放置，不要怕菌落长不不开，你用的这个化学转化法在每个平板上的菌落数也就不超过200个所以放心吧随便刮几下菌落就能长的很开，这个是我的亲身经历的不访考虑下。3）离心的转速对细菌会造成剪切，所以还是要稍微低一点，复苏摇菌是针对你的感受态的活性而定的。 |
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3楼2012-11-18 16:07:37
czdaeq
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【答案】应助回帖
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我倒是觉着，目的基因与感受态混合吹不吹打都无所谓（貌似用10ul的枪，在2ul左右量程下，吹打混匀效果不明显吧，汗一个），至于会不会把菌弄死，实际证明（mine）完全不会，而且宏观吹打的作用力，不太可能造成水分子的剧烈震动； 涂布棒，我用的是金属的（因为可以一个劲烧，不怕断），每次烧完浸入酒精（整个烧杯）中，冷却会，过下火焰（除去酒精），这就避免高温了，同时，你可以照2楼说的试试（这是规范操作）； 转化没长，原因除了2楼所述，还可能与你的质粒有关，转化前有没有跑个电泳看下浓度？质粒大小（10K以上不推荐化转）？ 楼主，还在纠结转化问题，那么应该是刚刚开始做分子实验吧？这个阶段最重要的是严格规范操作，做好实验记录，确保每个细节都与手册相符，想当年俺可是PCR，P了半个月才第一次P成功！！（泪~~~） 好好努力吧~~ |
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4楼2012-11-18 17:45:08