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[交流] 求助:如何进行生物碱的分离

最近老板把生物碱的分离的任务交给了我,
在分离极性比较大的部分时需要注意些什么?
但以前没有做过,请各位高手给指教指教!
万分感激!

[ Last edited by vhansen on 2007-7-19 at 14:47 ]

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1楼 2007-07-05 19:49:47

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patrickt

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生物碱在植物体内常与有机酸（如咖啡酸、枸橼酸、草酸、罂粟酸等）结合成盐。所以提取生物碱时，生药粉末可直接用酒精，稀酒精（60%～80%），水或酸水（一般用0.5%～1%硫酸或乙酸）浸泡，渗漉或加热提取。提取液蒸去水或酒精后，将所得胶质用2%左右稀酸水提取生物碱。如用稀醇提取，则所得浓水液加酸酸化，滤清酸水，用乙醚、氯仿洗涤，酸液用氨水，碳酸钠或石灰溶液碱化，游离出来的生物碱分别用乙醚、氯仿提取，即得总生物碱。如含有水溶性生物碱，则留在溶剂提取后的水溶液中。这个方法所得的生物碱含杂质较多，但用酒精比较经济、安全，所以适用于工业生产。也可将稀醇提取液通过大孔树脂柱吸附，而后用水洗净柱体，再用稀酸洗脱，浓缩可得总碱，如用不同浓度的醇洗脱，分别浓缩，则可初步分离总碱。
如用酸水提取，则将酸水液通过强酸性或弱酸性阳离子交换树脂，交换后，用水冲洗柱体，稀氨水洗脱，浓缩洗脱液，即得总生物碱。或用稀碱（NaOH）等洗脱，洗脱液用有机溶剂提取生物碱，或加酸使析出生物碱的盐。如用稀酸洗脱，洗脱液浓缩得到生物碱的盐。除用离子交换法以外，也可以将水提液加饱和盐水盐析，使生物碱或其盐类沉淀析出；或水提液浓缩后加碱碱化；或同时加盐水盐析，用氯仿等溶剂提取。有时加选定的酸于水提液中，使生成不溶于水的盐析出。
生物碱也可用氯仿、二氯甲烷或苯等与水不相混溶的溶剂提取。提取时应先将生药粉末与少量碱水（如1%左右氨水、碳酸钠或石灰水溶液）拌匀或磨匀至湿润为止，使生物碱转成游离状态，继用与水不相混溶的有机溶剂浸泡或渗漉（溶剂用量一般约为生药量的10倍），浸出液中的生物碱用稀酸水（如1%～2%盐酸）提取3～5次，至提取液不含生物碱为止。这时生物碱与酸成盐而转溶于酸水。酸水液滤清后，用乙醚或氯仿洗涤几次以除去一些脂溶性杂质，但有些生物碱盐也能溶于氯仿，因此含生物碱的氯仿洗涤液需再次处理。此后，酸水加碱水碱化，如有沉淀或结晶析出，滤出重结晶。碱水液先用乙醚，后用氯仿等溶剂分别提取3～5次，提取溶剂再用水洗涤1～2次以除去水溶性成分及碱水，用无水碳酸钾干燥，分别蒸干溶剂，常可借此分得两种性质不同的总生物碱。这样，有时乙醚提取不完全，则氯仿又可补充提取，但氯仿提取液中常含杂质较多，增加了分离工作的难度。提取溶剂可在碱化前即加入，这样，碱化时刚游离出来的生物碱立即转入有机溶剂，提取效率较高。这个方法用极性较小的溶剂提取，又在室温进行，所以得到的生物碱比醇提法纯净。而用苯提取时纯度更高，并可同时去除油脂，但苯有毒性大、易燃的缺点，应尽量避免使用。氯仿也属有毒溶剂，如用二氯乙烷则毒性降低。
弱碱性生物碱在植物中往往以游离状态存在，因此，可以用苯、氯仿等有机溶剂直接提取。而强碱仍以盐的状态留在植物体内。提取前应先用适量水湿润生药，使植物细胞膨胀后再用有机溶剂提取，以提高提取效率，或用稀的有机酸，如柠檬酸水等湿润生药，以便使一些中等强度的碱也能成盐而留在植物体内，再用有机溶剂提取。提取液经酸水抽提，酸水液碱化，氯仿抽提即得弱碱部分的总碱。如生药用水或稀醇提取，浓缩提取液，则因生药中常含一些有机酸而使浓缩液呈弱酸性，用氯仿等有机溶剂振摇，即可将游离弱碱提出（如喜树渗漉液浓缩后，pH为5.4，直接用氯仿可提取到喜树碱）。
水溶性生物碱和季铵碱不能被一般有机溶剂从水溶液中提出。可先加酸使溶液呈酸性，再通过阳离子交换树脂或加雷氏铵盐（Reineckate ammonium，NH4[Cr(NH3)2(SCN)4 ]•H2O）、磷钨酸、硅钨酸等，使成不溶于水的复盐析出，再通过树脂或用化学方法提出游离碱。此外，也可用丁醇或戊醇等从碱水溶液中直接萃取，如益母草中的水溶性成分益母草碱甲就是用戊醇提出的。
挥发性生物碱（如麻黄碱）可以用水蒸气蒸馏法提取，而易升华的生物碱可用升华法提取（如将茶叶未直接加热升华后，冷凝即得咖啡碱）。现在超临界流体提取（SFE）已逐渐普及，也可用于生物碱的提取。（见参考书目7）
用上述方法提取所得的总生物碱，应先用薄层层析检测含多少生物碱，各组分的大致比例，然后再选用下列方法分离与纯化。
分步结晶：利用各种生物碱在不同溶剂中的不同溶解度以达到分离目的，先将总碱溶于少量乙醚、丙酮或甲醇，放置，如果析出结晶，过滤，母液浓缩至少量或加入另一种溶剂往往又可得到其他生物碱结晶。
制备衍生物：许多生物碱的盐往往比游离碱更易于结晶，因此，可利用其盐在各种溶剂中的不同溶解度进行分离，分纯后再使转成游离碱。常用作制备盐的无机酸有盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸及过氯酸。有时也用氯金酸和氯铂酸。而有机酸有酒石酸、草酸、水杨酸、苦味酸和苦酮酸。其中以氢碘酸盐、过氯酸盐及苦味酸盐最易成结晶。含仲胺碱及叔胺碱的总碱可以利用仲胺与亚硝酸（常用NaNO2+H2SO4）成亚硝基衍生物，与氯乙酰或氯甲酸乙酯生成相应的酯，而叔胺则不起作用，使两者分离。仲胺衍生物加酸水解后又得原物。例如，石榴皮中的异石榴碱（isopelletierine）和甲基异石榴碱的分离即利用氯甲酸乙酯使前者生成相应的氨基甲酸乙酯（沸点150165℃／13 mmHg），而和后者（沸点114117℃／26 mmHg）不起作用，可蒸馏分开，石榴皮碱的氨基甲酸乙酯与浓盐酸加热至120130℃即析出纯石榴皮碱，同时放出二氧化碳及氯乙烷。有些总生物碱含酚性及非酚性生物碱，则可利用酚性化合物的弱酸性能与苛性碱生成可溶于水的酚盐这一性质而与非酚性生物碱分开。
利用不同酸碱度：碱度不同的混合生物碱在酸水溶液中加适量的碱液，有机溶剂萃取，则弱碱先游离析出转入有机溶剂层。强碱与酸成盐仍留在水溶液中。如逐步添加碱量，则游离出生物碱的碱性强度也逐步增强。反之，将总碱溶于有机溶剂，添加不足以中和总碱的适量酸水提取，则强碱先成盐而优先转入酸水层，提取得到生物碱的碱度随添加酸水量的增加而减弱。根据上述原理，可分离不同碱度的生物碱。操作时可用pH控制，或把添加的酸碱分成几个等份，如将总碱溶于计算量（即中和每克总碱至酸性时所耗酸的量，可预先小量试验求出）的酸中，加一定量的碱使中和一部分（1/5或1/10）酸，用有机溶剂萃取，然后再加一份碱，再用溶剂提取，这样即可得5份或10份先弱后强的不同碱度的生物碱。如加入酸计算量为100 ml 0.1 N盐酸，则每次加碱0.1 N氨水20 ml或苛性碱10 ml，即得相应5份和10份不同碱度的生物碱。如所加碱的浓度为1 N，则相应的只需加2 ml或1 ml。也可直接用不同pH的缓冲液提取。
分馏：由不同沸点组成的液体生物碱总碱，往往可以通过常压或减压分馏分离。如毒芹（Conium maculatum）中的毒芹碱和羟基毒芹碱，石榴皮中的伪石榴皮碱，异石榴皮碱和甲基异石榴皮碱等都可通过减压分馏法分离出来。
色谱法：当用一些简便方法还未能达到分离目的时，往往采用柱色谱层析法，目前常用硅胶柱在低压下快速分离，分离前先用薄层色谱选择最佳分离的溶剂系统，再行层析。氧化铝层析也是用得比较多的分离方法，这是由于许多生物碱极性较小，氧化铝对它们吸附较小，而杂质常被吸附，有时也可用凝胶层析，利用它的分子筛原理将不同分子量的生物碱进行分离。常用亲脂性葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，用甲醇或氯仿—甲醇混合液洗脱。
上述方法分得的单体均需经薄层层析检查纯度，单体必须是单一斑点，结晶必须经重结晶后晶体均匀，色泽均匀。熔距短（12℃以内），1H-NMR及MS谱中无杂质信号。有时还需用气相色谱层析和高效液相色谱层析经紫外（UV）、蒸发光散射（ELSD）或视差分析仪检查纯度。具体方法及实验可参考徐任生，陈仲良主编的《中草药有效成分的提取与分离》一书的有关章节及本章末介绍的有关参考书。