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muzi131122

铁虫 (初入文坛)

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[资源] [原创]RT-PCR初学者实验设计及注意事项

本人属RT-PCR初实验者，刚刚扩出第一条带，有几个经验想跟各位同仁分享。
RT-PCR分为几个步骤，大部分的同学都已知道，简述如下：
1实验准备阶段
2.总RNA抽提：关键在于氯仿加入后应较剧烈振荡，吸取上清时注意不要误吸蛋白层。总RNA浓度在0.1－5nmol/mol都是可以的。浓度低可能导致260/280值偏高，但如果在2.0左右问题也不大。
3.RT实验：可根据试剂盒说明做，也可先保温30度，10分钟，在保温快结束前再加反转录酶。试验者可尝试不同效果。
4.PCR实验
第一第二步容易进入状况，本人不作赘述。第三第四有些诀窍。本人购买的是TAKALA试剂盒VERSION3.0，故以此为例，阐述如下：
首先，请初学者按试剂盒说明书先做control实验。control实验可让你明白整个过程，并且了解你的试剂盒特别是酶的活性是否处于正常状态，而且对本实验室的PCR的条件有个大概的了解。当control实验成功出现预期条带的时候，你对自己的信心也会倍增。
第二，因为本试剂盒跟其他两步法有些不一样，RT-反应体系只有10ul，而PCR反应液每次40ul，RT-是比较容易完成的，但是PCR反应的条件必须要摸索，如果全按试剂盒要求去做，试剂就非常浪费。所以有经验如下：
摸索时候：同一目的片断：本人将RT-反应液加入PCR反应液后将其分为两管，每管25ul，甚至再分，每管12.5ul，然后分为不同温度梯度（PCR仪固有功能）进行PCR，实践证明，每管12.5ul的反应体系是可行的，实验结果出现了明显清晰的条带。所以，每个反应体系50ul就可分为4个12.5ul，把原先试剂盒的100次扩增为400次。大大增加利用率，节省您的开支。
第三：初学者切记慌张着急。在实验前必须先做好实验设计。
RT-按照说明书做下来一般没有问题，但是PCR的关键处在于摸索以下三项：
1. 退火温度：引物合成公司一般提供引物TM值，可根据TM值（TM）值居中设定温度梯度进行试验，找到最佳的退火温度。如用以上建议，只需用试剂盒一次量，每管12.5ul，可实现4个温度梯度每个梯度（1度左右），一次便可摸索出来。但退火温度宁低，低的退火温度可保证扩增出条带，但有可能扩出非特异性条带。
2. 延伸时间：一般72度左右，按1kb/min算，但是可稍长些，太长也可引起非特异性扩增。
3. 循环次数：循环数太高，进入平台期后，比较指标的大小意义就不大了，一般取线性增长期，并且可在电泳时跑出较好的条带为佳。可设计如下：
如每管25ul，文献报道为30循环，可从27循环开始，每三个循环取5ul另分装在PCR管中，做好标记。可获得27，30，33，36，39 五个循环数的条带，跑电泳后如果读取灰度值，可根据灰度制成线性曲线，取线性增长期的其中一点。保证条带亮即可。
以上摸索条件清楚了，就可成批做了，艰难的岁月算过去了，接下来就是按部就班了。
感谢您关注我的经验，祝您实验顺利。希望以后多交流！谢谢！

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