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【答案】应助回帖
小冀-: 应助指数+1 2019-11-26 09:44:46
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什么是chip-seq？ chip-seq是染色质免疫沉淀测序的简称。 基本上，chip-seq是与dna结合蛋白共沉淀的基因组dna片段的测序。 以这种方式最常研究的dna结合蛋白是转录因子（例如p53或nfκb），染色质修饰酶（例如p300，组蛋白去乙酰化酶），与基因组dna相互作用的组蛋白修饰（例如h3k4me3）和转录复合物成分（例如rna polii）。 从技术上讲，这项技术可以无偏见地识别与特定dna结合蛋白相关的基因组中的所有dna片段。 我们说“无偏见”，因为免疫沉淀物中的所有dna都会被测序，因此该技术不需要预先知道精确的dna结合位点。 通过了解蛋白质的dna结合位点，如转录因子，我们能了解什么？ 相当多转录因子的主要功能是识别并结合到基因组中的特定位点，招募辅因子，从而调节转录。 转录因子的第一个作用是发现并结合dna片段，并且chip-seq允许在整个基因组范围上鉴定转录因子的结合位点。可以计算被结合蛋白识别的dna序列motif; 基因组中的任何转录因子的精确调控位点都可以被识别; 可以确定任何转录因子的直接下游目标; 并且可以预测特定dna位点处转录调节蛋白群。 chip-seq实验怎么做？ 第一步取决于正在研究的蛋白质（图1）。对于许多蛋白质-dna相互作用，特别是对于瞬时结合因子，第一步可能是使用甲醛作为交联剂来固定相互作用。然而，这对于定位组蛋白修饰或简单地核小体定位可能不是必需的，因为组蛋白-dna相互作用即使在没有交联剂的情况，一般也已足够强，在这种情况下，不需要交联的天然chip（n-chip）可能是更合适的[1]。在研究染色质重塑酶，例如组蛋白去乙酰化酶（hdacs）或组蛋白乙酰转移酶（hats）时，可以在与甲醛交联之前，增加额外的交联步骤（使用双琥珀酰亚胺戊二酸酯）以保留蛋白质-蛋白质复合物[ 2]。交联后，将染色质片段化成约150-500bp的片段。对于交联条件下的转录因子chip，染色质片段化是使用超声处理完成的。获得足够的、可重复的片段非常重要，因为制备后续的测序文库需要片段大小为200-300bp。对于n-chip，用微球菌核酸酶消化dna以提供稍微更好的分辨率，因为它能将使核小体切成最小单位（大约150bp）。 片段化后，下一步就是使用目的蛋白的特异性抗体进行免疫共沉淀。 chip-seq实验的成功与否主要取决于与研究蛋白特异性结合染色质的显著富集。 通常我们检测多种抗体，选择一处dna始终都能显著富集的位点作为阳性结合位点，并与非特异性对照抗体如抗-igg免疫沉淀的dna进行比较，确定阴性对照位点没有富集。 一旦富集可信，该材料就可以进行测序了。 如果材料的数量不是限制因素（例如，来自组织培养），用于文库制备的dna量约为10至15 ng。 如果测序平台需要掺入接头并涉及pcr扩增步骤，则这可能形成相当大的偏差[3,4]，建议尽可能降低循环次数。 一旦材料被扩增，选择长度为200至300bp的dna片段并测序。在pcr之前和之后，都存在交叉污染的风险，但可以通过制备非常少量的并行文库并在纯化扩增文库时使用单独的凝胶，使风险最小化。 当材料有限时，如原代细胞或组织样品，则需要使用较低起始量的dna建库。 通常是以增大扩增倍数作为代价，这引入了扩增偏差。 然而，避免这种情况的一种方法可能是使用helicos下一代单分子测序平台，该平台可以以50pg作起始材料生成测序文库而不需要扩增[4]。 最后，将短序列片段（称为tags）通过与参照基因组进行比对进计算，并鉴定出富集区域，称为峰呼叫步骤。 |
2楼2019-11-25 11:20:52
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