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greenhope3371

铜虫 (正式写手)

[交流] 实时定量模板统一量是提材料 or RNA初始量 or 反转录后的cDNA量一样？ 已有5人参与

1、实时定量模板统一量是提RNA的组织材料量一样还是RNA初始量一样，还是反转录后的cDNA量一样？
第二个问题，三重复是加样的重复，还是不同模板PCR的重复？
欢迎热烈讨论，共同提高！

先说我们自己的是RNA初始量一致，然后反转录；
另外三重复是每板PCR中每个PCR三次加样重复，当然还需另外做不同模板PCR重复
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努力
1楼 2012-09-28 10:26:59
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励分享经验 2012-09-28 14:48:18
嗯.................
       我们的做法是
         1. 统一的样品量，保证提出了的一样的基因，我们老板认为不同的初始样品量可能会导致小样品量的可能提不出某些低表达量基因，所以会有平行误差。
         2. RNA提取完成后按照浓度值上统一的模板量做RT
         3. cDNA没有有效方法测定统一量，所以一般普遍认定同样量RT出来的都是同样量cDNA。
       关于重复的东西请见偶的帖子：我在里边阐述咯，请移步
         http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4318668  
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
4楼2012-09-28 12:37:29
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的做法和我们基本是一样的，严格来说你还要做生物学重复，不指示技术重复！
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-09-28 11:28:15
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-28 14:47:57
1，控制初始RNA量一致，然后反转录是对的。
2，请做至少3次生物学重复，和至少2次技术重复。
3，请用内参来NORMALISE 你的结果。
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3楼2012-09-28 12:13:07
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们通常的做法是从一开始的材料就定量，这样能保证在后面的定量过程中不至于造成高浓度的加样太少而低浓度加样太高而造成的误差，甚至加样量超出反应体系的情况。最终的cDNA不太好定量，但是可以通过普通PCR扩增内标大体看一下。我们一般做是每板3-4重复孔，同一扩增重复三次。
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5楼2012-09-28 15:19:07
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