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PCR反应体系中各种成分的作用-搜集版
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最近PCR总是P不出来 于是看了些版的讨论 以下为搜集的讨论资料 对PCR条件优化进行了比较详细的分析 希望对大家有帮助 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 不同模板浓度的实验结果 用相同的引物、两种不同的模板,对6种不同模板量进行ＰＣＲ扩增,发现在模板量<25ｎｇ的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约到2ｎｇ左右时无扩增产物;当模板量在25ｎｇ～200ｎｇ之间时,扩增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量>200ｎｇ时,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑,在25μｌ的ＰＣＲ反应体系中,模板ＤＮＡ以25～100ｎｇ为最适用量。同时模板ＤＮＡ在200ｎｇ以下不影响扩增结果,但为降低ＴＥ缓冲液中ＥＤＴＡ对反应体系中Ｍｇ2+的不良影响程度,应该尽量降低ＤＮＡ模板用量。 不同Ｍｇ2+浓度时实验结果 设置不同Ｍｇ2+浓度,当Ｍｇ2+浓度为1 0ｍＭ时,无ＰＣＲ扩增产物;Ｍｇ2+浓度为1 5～2 5ｍＭ时,随着Ｍｇ2+浓度的增加,ＰＣＲ扩增产物带型基本一致,但以2 0ｍＭ的扩增效果最好 不同引物浓度对ＰＣＲ结果的影响 设置5种不同浓度的引物进行ＰＣＲ扩增,当引物浓度在0 1～0 2μＭ时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0 .2μＭ左右为宜。 不同ｄＮＴＰ浓度对ＰＣＲ结果的影响 采用2种引物(ＯＰＢ17、ＯＰＡ16),分别以4种不同的ｄＮＴＰ浓度进行ＰＣＲ反应,发现ｄＮＴＰ浓度在100μＭ、150μＭ、200μＭ、300μＭ时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱,当ｄＮＴＰ浓度<200μＭ时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产率与ｄＮＴＰ浓度呈正相关。综合考虑,以100～200μＭ的ｄＮＴＰ浓度为佳。 ＴａｑＤＮＡ聚合酶对扩增结果的影响 设置5个梯度的ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度,结果表明随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在0 5ｕ～2 5ｕ浓度间均有扩增产物,但随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度增加的同时,弥散背景也相应增强。综合考虑,ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度以1 0～1 5ｕ结果较好 不同退火温度下的扩增效果 引物用ＯＰＤ16和ＯＰＡ01,按照优化的ＰＣＲ反应体系将退火温度分别设置为33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增加。 Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ互相作用及对ＰＣＲ反应的影响 用同一引物ＯＰＤ07、相同模板ＤＮＡ比较3种Ｍｇ Ｃｌ2浓度与3种ｄＮＴＰ浓度完全随机相结合的9个处理的ＰＣＲ结果,研究了Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ的相互作用。结果表明,Ｍｇｃｌ2在低浓度时,过量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+的螯合作用明显,表现为降低Ｍｇ2+的酶催作用,ＰＣＲ扩增产物减少或无,而低量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+酶催的抑制作用减少,ＰＣＲ扩增产物增多。在高浓度Ｍｇｃｌ2浓度下,ｄＮＴＰ无抑制作用。在相同Ｍｇ2+离子浓度和足量ｄＮＴＰ时,扩增产物相似。1-9泳道分别代表Ｍｇｃｌ2(ｍＭ)/ｄＮＴＰ(μＭ)的浓度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、3/300)。 以下略.... |
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2012-09-12 10:07:17, 258.81 K
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