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cnhellfire

木虫 (著名写手)

[求助] 悬赏5个bb,PEG化蛋白跑电泳怪现象

最近做蛋白PEG化,为什么反应液跑电泳,30分钟取样跑不出来,4小时的能跑出来呢?请教有经验的。
电泳是银染,12%的胶

2012-09-12 09.35.03.jpg
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huquan0_0

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
对蛋白的修饰是修饰在巯基上还是氨基上?
如果是氨基的话,PEG修饰会导致蛋白电荷(等电点)、体积的发生明显的变化。条带的位置和跑胶时候的PH、修饰的数量都有很大的关系,也难说清楚。
如果要进行一个修饰数量的表征,推荐做飞行时间质谱。

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海纳百川有容乃大;自强不息止于至善。
2楼2012-09-12 12:35:00
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cnhellfire

木虫 (著名写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by huquan0_0 at 2012-09-12 12:35:00
对蛋白的修饰是修饰在巯基上还是氨基上?
如果是氨基的话,PEG修饰会导致蛋白电荷(等电点)、体积的发生明显的变化。条带的位置和跑胶时候的PH、修饰的数量都有很大的关系,也难说清楚。
如果要进行一个修饰数量 ...

实在氨基上。我不明白为什么4小时取样的样品能跑出来,而30分钟取样的样品却跑不出来呢?如果是因为PEG的修饰影响的话,4小时的样品也应该跑不出来啊。
3楼2012-09-13 12:32:26
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huquan0_0

捐助贵宾 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cnhellfire at 2012-09-13 12:32:26
实在氨基上。我不明白为什么4小时取样的样品能跑出来,而30分钟取样的样品却跑不出来呢?如果是因为PEG的修饰影响的话,4小时的样品也应该跑不出来啊。...

我觉得你是不是加错样品了啊   呵呵   你要不要重新在做下

用NHS活性酯的话,30min和4小时差别应该不是很大,NHS在水中水解很快,一般15min的半衰期。

你重新在做下这个实验吧。
海纳百川有容乃大;自强不息止于至善。
4楼2012-09-13 13:20:49
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加内特

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用SDS-PAGE试试?蛋白变性后更好些,可以区分分子量大小。
顺便问一下你修饰的是什么蛋白质?我也在做PEG修饰。
少壮不努力,老大徒伤悲!
5楼2012-09-13 14:47:28
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cnhellfire

木虫 (著名写手)

谢谢楼上各位,这个试验我重复过一次,现象是一样的。第二次上样的时候还特意找了质检的在旁边复核的,应该不是操作错了。我用的就是还原电泳。中间还加做了一个蛋白和PEG添加了以后直接跑样,没有问题。会不会是因为没有纯化,反应液中有过量的PEG,对蛋白在电泳的时候造成影响?
6楼2012-09-13 16:04:51
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