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daiqiguang

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[资源] 液相色谱-质谱／质谱联用技术的进展及应用（转贴）

液相色谱-质谱／质谱联用技术的进展及应用

作者：方晓明，张社来源：检验检疫科学

摘要：简介了液相色谱-质谱，质谱联用技术的新进展，综述了近年来该技术的应用及其发展前景。引用文献24篇。
关键词：液相色谱质谱，质谱综述

1 前言
近年来，由于液相色谱-质谱，质谱(LC-MS／MS)联用新技术的不断出现，LC-MS／MS已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。LC／MS的联用始于70年代，90年代以来，由于大气压电离的成功应用以及质谱本身的发展，液相色谱与质谱的联用，特别是与串联质谱(MS/MS)的联用得到了极大的重视和发展。LC-MS／MS联用的优点非常显著，因为气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质，而液相色谱则把分离范围大大拓宽了，生物大分子也能分离，LC与高选择性、高灵敏度的MS／MS结合，可对复杂样品进行实时分析，即使在LC难分离的情况下，只要通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混和物中的目标化合物，显著提高信噪比。
液-质联用是通过一个“接口”来实现的。在接口研制方面，前后发展了有20多种，其中主要有直接导入界面、传送带界面、渗透薄膜界面、热喷雾界面和粒子束界面，但这些技术都有不同方面的限制和缺陷，直到大气压电离技术成熟后，液-质联用才得以迅速发展，成为科研和日常分析的有力工具。

2 接口基本原理
有关各种电离技术文献已有评述，目前主要采用大气压电离(API)技术，API包括电喷雾电离(跚)和大气压化学电离(APCI)。

2．1 电喷雾电离(ESI)
溶液中样品流出毛细管喷口后，在雾化气(N2)和强电场(3～6kV)作用下，溶液迅速雾化并产生高电荷液滴。随着液滴的挥发，电场增强，离子向液滴表面移动并从表面挥发，产生单电荷或多电荷离子。通常小分子得[M+H]+ 或[M-H]-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测量的是质，荷比(m/z)，可测定的生物大分子的质量数高达几十万。
ESI是很软的电离，可直接测定热不稳定的极性化合物，多电荷形成可分析蛋白质和DNA等生物大分子，调节离子源(源内ID))电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。

2．2 大气压化学电离(APCI)
溶液中样品流出毛细管后仍由氮气流雾化到加热管中被挥发，在加热管端的Corona尖端放电电极(最初利用同位素Ni的电子放射)使溶剂分子形成反应气等离子体。样品分子与等离子体通过氢质子交换被电离，形成[M+H]+或[M-H]-，并进入质谱仪。
APCI也是很软的电离，只产生单电荷峰，适合测定弱极性的小分子化合物。另外，它适应高流量的梯度洗脱，高低水溶液变换的流动相。通过调节离子源电压，可以得到不同断裂的质谱图。

2．3 接口形式
接口是液-质联用的关键部分，在这里完成溶液的气化和样品分子的电离。由于大量生物样品的背景基底非常复杂，即使经过分离，还会很“脏”。因此在接口设计时，既要考虑离子化的效率，亦要考虑接口的抗污染和耐用。图给出了几种不同的API“接口”形式，采用Z字形通道离子束引进系统，避免了中性或非挥发性物质直接进入采样孔，可有效地防止接口的玷污。

3 应用
LC-MS／MS联用是继GC／MS联用之后又一新兴的分离检测技术，近来发展极为迅速。它在生命科学、环境科学、法医学、商检等领域得到了广泛应用。

3．1 药物及体内药物分析
药物的是用来预防、诊断及治疗疾病的一类特殊物质，与人们的健康和生命安危有极其密切的关系，杂质检查及其限度控制是保证药品质量的一个重要方面。使用LC-MS／MS可以简便地对药物中杂质加以监控。Nicolas对抗癌药物DuP941生产中有关杂质建立了LC-MS／MS指纹图谱，不同生产的批次药物与已建立的谱图对照，从而达到质量控制目的。Zhao鉴别和测定了氯沙坦片剂在储存过程中产生的微量降解产物。Rourick建立了鉴定药品杂质及降解产物的LC-MS／MS方法，如头孢羟氨苄通过酸碱或加热处理使其降解，然后反相C18柱分离，利用MS／MS功能来鉴定杂质及降解产物的化学结构。
体内药物分析是测定体液(主要是血浆、血清或全血)中药物或其他代谢物浓度。由于血液样品试样提供量少，基质复杂，在此混合物中分析某种微量成分(通常为(g/mL或ng/mL水平)并加以鉴别，常常是对分析化学家的挑战。
LC-MS虽然有足够的灵敏度，但遇到LC难以分离的组分，其应用受到限制。使用LC-MS／MS可以克服背景干扰，通过MS／MS的选择反应控制模式(SRM)或多反应检测模式(SRM)，提高信噪比，因此对复杂样品仍可达到很高的灵敏度。LC-MS／MS对生物样品的提取、纯化和浓缩等前处理过程没有严格要求，一般采用液液萃取法(LLE)或固相萃取法(SPE)，但这两种方法的缺点是比较费时。在线萃取技术在省时和省力方面显出相当大的优越性。现有几种在线萃取技术，如在线固相萃取、柱切换、涂层毛细管微萃取(CCME，有时又称固相微萃取(SPME)、多元LC系统等。在线萃取技术使得LC-MS／MS优点更加明显，它可以实现微量、高通量样品分析。
Xia用两根平行的样品前处理柱Oasis HLB(1×50mm，3μm)分别与一根分析柱相连接，利用柱切换技术在两根平行的样品处理柱之间交替进行净化、富集。此方法的样品量仅为10μL，净化时间0.3min，整个样品分析时间1.6min，而且方法精密度很好，日内、日间误差6.6％。Hempenius将96孔固相萃取装置与LC-MS／MS相联，血浆样品直接注入孔内的SPE柱中，净化后的样品再经LC分离，MS／MS采用选择反应检测模式(SRM)，血浆样品中的氟哌啶醇检测限为0.1ng／mL，方法不准确度<10％，样品分析时间约1.9min。Takeshi对血液或尿液中11个添加的吩噻嗪类药物进行了分析，采用SPME法，样品在毛细管内壁涂层中经过选择性吸附与解吸，再经LC分离，MS或MS／MS检测。Wong开展了微透析-LC-MS／MS生物活体分析，方法是将微透析探针直接插入鼠的颈静脉中，松果体素腹膜内注射后，透析液(连续15h，每隔0.5h)被自动注入到1.12-MS／MS仪中进行分析，实时了解松果体素在体内的生化过程及代谢情况。另外，Wong采用相类似的方法，将微透析探针插入鼠脑纹状体中，对神经递质乙酰胆碱进行微小环境的活体分析。手性药物在制药行业中有着特殊意义，高通量手性液相串联质谱可及时了解对映体在体内代谢过程，是手性药物研究有力工具。LC-MS／MS可以鉴别分析体液中各种类型的药物，文献已报道有：罗丁诺森、茚地那韦、叠氮胸苷、齐多夫定、安替比林、奥美拉唑、恩丹西酮、孕三烯酮、右美沙芬、氟尼缩松、特乐福本、抗炎松、特比奈芬、新伐他丁、利多卡因、苯海拉明、雷帕霉素、利布乐定、福辛普利、普萘洛尔、普罗帕酮等。
天然产物(中药材)成分复杂，对这些产物的分析，以及对其中活性成分鉴定确实困难。而LC-MS／MS可对天然产物进行成分鉴定和测定，如生晒参中人参皂甙、蒺藜中甾体皂甙、紫杉中紫杉醇、盾叶鬼臼根茎中木酚素和绿茶中儿茶素等。

3．2 兴奋剂，毒品检测
1980年国际奥林匹克委员会把阿片、可卡因、麦角酰二乙胺(LSD)、苯丙胺、大麻、苯二氮卓和促蛋白合成类固醇列为禁用药物，这些药物在体内主要以代谢产物形式存在。例如，阿片类含有酚羟基或醇基等，很容易与人体内的葡糖醛酸结合；合成类固醇在体内以睾酮形式代谢。兴奋剂，毒品检测主要是根据尿液或血液中相当代谢产物的测定浓度，LC-MS／MS已被证明是一个有力工具。
Cailleux采用液-液提取，细径C18柱分离，ESI源MRM检测，分析了血液和尿液中阿片及其代谢产物(吗啡、6-乙酰吗啡、可待因和去甲可待因)，检测低限10ng／alL。Salwson测定了血浆中吗啡及其代两个代谢产物吗啡一3-葡糖苷酸(M3G)和吗啡-6-葡糖苷酸(M6G)，对静脉注射吗啡(剂量0.14mg／kg)的吸毒者，在12小时内采的血样分析得到：吗啡，535pg／mL；M3G，17722pg／mL；M6G，3074pg／mL。Singh将样品通过加入乙晴沉降蛋白，上清液注入反相YMC base柱分离，APCI源MRM检测，测定了血浆中可卡因及其主要代谢物(苯甲酰爱康宁、爱康宁甲酯和去甲爱康宁)，线性范围2～1000ng／mL，误差<4.1％。Soenoff 建立了新生婴儿血液(12μL)中苯甲酰爱康宁的确证方法，对可疑吸毒者出生的婴儿进行鉴定。Wang通过标准品和改变ClD源，对可卡因及其15个重要代谢产物的裂解机理作了探讨。Clauwaen测定了头发中可卡因及其代谢物苯甲酰爱康宁与可卡乙碱，结果与LC/荧光检测的结果一致。Clauwaen用LC-Q-TOF MS测定了血液中苯丙胺和相关化合物，结果与LC/荧光检测法相一致，但线性动态范围要高出2个数量级，在极低浓度时仍可进行MS／MS全扫描，对目标化合物进行绝对鉴定。Gergov建立了尿液样品中16个β-兴奋剂筛选及确证的方法，采用MS1的SIN模式筛选，呈阳性结果再经MS／MS产物离子扫描，通过谱库检索，得到准确的鉴定。Cai用免疫亲合柱提取尿液样品中的LSD，微径C18柱分离，ESI源MRM检测，检出低限2.5pg/mL。另外，文献还报道了体液中苯二氮卓、合成opioids、促蛋白合廊类固醇，以及天然生物碱如天仙子胺、利血平等LC-MS／MS测定方法。

3．3 农药，兽药残留量分析
食品中的农药残留量及其他有害成分的含量甚微，往往需要进行痕量分析，对分析方法的灵敏度要求较高。而LC-MS／MS具有极高的灵敏度，特别适合进行痕量分析，可以鉴别和测定各种类型的农药、兽药以及生物毒素等残留物。如：蔬菜中杀虫剂；谷物中矮壮素、瓜萎镰菌醇；动物组织(肌肉、脂肪、肝、和肾)中庆大霉素、磺胺二甲嘧啶和甲氨苄氨嘧啶；肉制品中聚醚离子载体类兽药(拉沙里菌素、莫能菌素、奈良菌素和盐霉素)、杂环芳胺；鸡蛋中硝基咪唑类；牛奶中庆大霉素和新霉素；啤酒中玉米赤霉烯酮；甲壳类水生物中yessotoxin毒素、azaspiracid毒素；土壤中咪唑啉酮；水样(废水、河水、地下水和饮用水)中苯磺酸根、除草剂、杀虫剂等残留物的鉴别和测定均有报道。

3．4 生物大分子分析
LC-MS／MS可实现蛋白质的快速高灵敏度鉴别和测定，蛋白质酶解后，产生多个肽段，经过LC分离，用MS／MS可获得肽的质量谱，因此可对肽段进行鉴别和测定；通过蛋白质序列数据检索，可得出蛋白质序列信息。利用LC-MS／MS还可以开展DNA-药物结合态分析，肽及蛋白质与金属离子配位研究等。

4 展望
与已成熟的GC—MS联用技术相比较，LC-MS／MS联用技术还处于初期发展阶段，它的应用才刚刚起步。但LC-MS／MS所具备的一系列优点，决定了它的应用前景比GC-MS更为广泛。在“接口”方面，API接口的成功应用，使得液-质联用成为可能。在对大分子和小分子化合物分析中，展现了它作为通用接口的广阔应用前景。采用API Nanospray接口。适合于分析超微量的样品，如生化样品或法医样品，灵敏度可高达fmol，能够实现微径HPLC与质谱的联用，这是近来的一个发展趋势。
在串联质谱方面，目前以四极杆串联质谱为主，它可进行MS1和MS2操作(空间上)。离子阱质谱和富利叶变换质谱(FT—ICR—MS)亦可完成多级串联质谱分析(时间上)，离子阱质谱通过改变阱里射频场最多可进行10级MS操作，FT-ICR-MS通过离子回旋共振进行多级MS操作。飞行时间质谱(TOF)作为第二个质量分析器，由于其分辨率高、质量范围宽、扫描快和灵敏度高等优点，成为一个重要的发展方向。
LC-MS／MS联用技术愈来愈多地受到人们的重视，一些国际著名的分析仪器公司和研究机构建立多个研究实验室参于研究开发。总之，为应用目的而建立的LC-MS／MS联用技术会越来越多，应用研究课题也会越来越多。

参考文献
1 NIESSENW MA．[J]．J Chromatogr A，1998，794：407～435
2 NICOLAS E C，SCHOIZ T H．[J]．J Pharm Biomed Anal，1998，16(5)：825～836

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