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蛋白质组学研究进展与应用
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随着人类基因组草图2001年的正式发表和2003年4月的最终完成，科学家们又进一步提出了后基因组计划，蛋白质组(Pmteome)研究便是其中一个很重要的内容。蛋白质组学(Proteomics)也正是作为功能基因组学的重要支柱在20世纪90年代应运而生，并已成为新世纪生命科学研究的前沿和热门领域。 1 蛋白质组学概念及研究的必要性 蛋白质组Proteome源于Protein与Genome两词的杂合，最早是由澳大利亚学者Wilkins和Williams 于1994年提出的，并首次于1995年7月在Electrophoresis上发表，即细胞或组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质。蛋白质组学则以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。 蛋白质有其自身特定的活动规律，这些通常都无法直接从基因组的信息中反映出来。这是因为基因组是均一的，在同一生物个体的不同细胞中基本相同，而且它是静态的，比较稳定而不易改变。蛋白质组则具有多样性，同一生物个体的不同细胞中所含蛋白质的种类和数量都不相同，并且它是动态的，不断地改变着，即使是同一种细胞，在不同时期或在不同环境条件下，其蛋白质组分也在不断地发生着变化。更重要的是，从基因中得到的蛋白质的信息是不完整的，比如在基因组水平上无法获知蛋白质的结构形成、修饰加工、转运定位、蛋白质与蛋白质相互作用等活动。因此，若要精确地研究基因的功能，解释复杂的生命现象，就必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究，即进行蛋白质组学的研究。 2 蛋白质组学研究的策略和趋势 蛋白质组学自其出现起，就有两种研究策略。一种可称为“穷尽法”(或“竭泽法”)，即采用高通量的蛋白质组研究技术，力图查清生物体内一切蛋白质，这种大规模、系统性的策略较为符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质种类繁多，表达随空间和时间不断变化，且目前高通量研究的技术尚不成熟，短期内要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标，因此这方面的研究和投资与初期相比已有明显降温。人们逐渐转向另一种策略：“差异法”（也称为“功能法”），它着重于寻找和筛选任何有意义的因素引起的不同样本之间的差异蛋白质谱，试图揭示细胞对此因素的反应途径、进程与本质，同时获得对某些关键蛋白的认识和功能分析。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法，技术上具有更高的可实现性，在疾病的早期诊断、病程监测、药效分析等方面的应用价值十分显著，是目前蛋白质组学在应用上最具前景的领域。 随着蛋白质组学研究的深入，又出现了一些新的研究趋势： (1)相互作用蛋白质组学。又称为“细胞图谱”蛋白质组学，它包含两个方面的内容：研究蛋白质之间相互作用的网络；分析蛋白质复合体的组成。目前这方面的研究较热。 (2)亚细胞蛋白质组学。不同蛋白质在细胞中有不同的定位，在某一亚细胞结构内的所有蛋白质因相互作用较紧密而构成一个小整体，因此又派生出一个与空间密切相关的新领域：亚细胞蛋白质组学，例如细胞器蛋白质组、核膜蛋白质组等。 (3)定量蛋白质组学。即对蛋白质的差异表达进行准确的定量分析。这标志着蛋白质组学研究开始从简单的定性朝向精确的定量方向发展，并已逐渐成为蛋白质组研究的新前沿。 3 蛋白质组学研究技术与进展 3.1 蛋白质分离和鉴定技术 3.1.1 双向凝胶电泳 双向凝胶电泳(2-dimentional gel electrophoresis)是目前蛋白质组学研究的核心技术，其原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，到达各自的等电点；随后在沿垂直的方向按分子量进行分离。 1982年固相化pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)应用于2-DE，解决了pH梯度不稳的问题，对2-DE的重复性和分辨率的提高具有里程碑的意义，使2-DE真正成为了蛋白质组分析的核心技术。 随后，为了分离复杂的蛋白样品和低拷贝蛋白，发展了窄IPG胶条技术，把pH梯度范围缩小至 1～1.5，提高了等电聚焦的分辨率。还有超窄pH梯度胶的应用，可减少pH相近的共同迁移蛋白质数量，显示出了更好的分离性能。 近来，采用蛋白质组重叠群。即利用多个不同pH梯度和分子量上相互重叠的2-DE图谱，拼接成一张完整的2-DE，大大提高了分辨率和进样量，这对于低丰度蛋白的检出十分有利。 3.1.2 质谱分析 质谱(MS)的基本原理是在样品离子化后，根据不同离子其质荷比的不同进行分离并确定分子量。以前的质谱由于难以解决高分子化合物的离子化问题而仅限于分析小分子化合物，直到基质辅助的激光解吸电离和电喷雾电离这两种新的电离技术的出现，才使质谱广泛用于蛋白质的鉴定，并已成为蛋白质组学研究的支撑技术。 近年来质谱的装置和技术不断完善发展。比如可以不再经过胶分离和酶解而直接用质谱鉴定蛋白质，先用蛋白质粗提物先进行毛细管电泳分离，然后直接加至傅立叶离子回旋加速器核磁共振质谱仪，一次就能获得多个蛋白的精确分子量。 另一种MALDI四极杆飞行时间质谱。即把MALDI离子源与一个高效串联质谱仪相连，并结合肽质指纹图和肽序列标签对蛋白质进行鉴定，可大大提高鉴定的特异性和准确率。 此外又出现了把两个飞行时间质量分析器串联在一起的MAL-DI-TOF-TOF质谱，它具有 MALDI-Q-TOF的许多优点，使质谱真正发展为高通量的蛋白质测序工具。 3.1.3 ICAT技术 ICAT(Isotope Coded Affinity Tages，同位素标记亲和标签)技术目前已成为蛋白组研究的核心技术之一。它是在质谱技术的基础上发展起来的一种定量质谱法，能够精确地分析不同样品中蛋白质表达量的差异，从而使蛋白质组学真正成为一种差异显示技术。 此技术是用具有不同质量的小分子试剂ICAT去标记处于不同状态下的细胞中的蛋白质，再利用串联质谱技术，就能非常准确地比较出两份样品中蛋白质表达水平的不同。ICAT技术的优点在于它可以对混合样品进行直接测试而不需分离，能够迅速地定性和定量鉴定低丰度蛋白质，故可用于快速临床诊断。因此虽然目前ICAT还存在一些不足，但仍然具有巨大的应用价值。 3.1.4 蛋白质芯片 蛋白质芯片的基本原理与基因芯片相似，为一些表面经过特殊修饰的载体，不同种类的芯片可以选择性地吸附不同的蛋白质。这些芯片可通过与特殊的配基、抗体、离子或疏水基团相连来选择性地吸附我们所需的目的蛋白质。蛋白质芯片一次可以快速分析多种蛋白质，因此是一项很有前途的技术。 随着自动化的发展。一些实验室将蛋白质芯片技术与质谱联用，通过质谱直接显示反应结果。如生物传感芯片和质谱联用，可极大地提高自动化程度与分析检测的灵敏度。还有新近发展的表面增强蛋白质芯片技术，也是一种基于质谱的蛋白质组分析技术。 3.2 蛋白质相互作用组学分析技术 3.2.1 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。 在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 3.2.2 噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 3.2.3 表面等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 除以上技术外，用于蛋白质相互作用研究的方法还有亲和层析免疫沉淀、荧光能量转移技术、抗体与蛋白质阵列技术等，并且还不断有新的技术涌现出来。 3.3 蛋白质组生物信息学 蛋白质组学研究的整个过程中无论是双向电泳图谱的分析，还是质谱数据的解析，或是实验室间的相互比较，或是最终蛋白质组数据库的建立，其数据量之巨大在生物学上是史无前例的，这就必须要有高度自动化的处理，包括数据的输入、储存、加工、索取以及数据库之间的联系。因此生物信息学已成为蛋白质组学研究中一个不可缺少的组成部分，其应用主要包括：数据库建立、蛋白质结构预测、分子进化，以及各种分析、搜索软件的开发等。 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础，数据库的种类繁多，包括蛋白质序列数据库、质谱数据库、双向电泳图谱数据库等等。最常用的数据库有SWISS2PROT、TrEMBL以及NCBI的非冗余蛋白质序列数据库。其中SWISS2PROT是真正的蛋白质序列数据库，也是目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库，而TrEMBL是收集自动从核酸翻译而来还没有进入SWISS2PROT的蛋白质序列， nrNCBI则包含了由GenBank中的DNA翻译而来的以及PDB、SWISS2PROT和PIR数据库中的蛋白质序列。 目前许多与蛋白质组相关的分析、搜索软件可通过与EXPASY蛋白质组学服务器链接而获得。这些软件可用于查找所需信息，鉴定蛋白质的种类，分析蛋白质的理化特性，预测可能的翻译后修饰以及蛋白质的三维结构。蛋白质组研究中常用到的软件工具主要有蛋白质双向电泳图谱分析软件，比较知名的有Melanie3、PDQuest6.1、Progenesis、Delta 2D等。 随着蛋白质组数据库的不断完善和各种相关软件的不断发展，蛋白质组学必将如虎添翼，更加迅速地发展。 4 蛋白质组学的应用 由于蛋白质是生命活动的直接执行者，蛋白质组学研究的一大特色，便是从一开始其基础研究就与应用研究呈现齐头并进的趋势。它的应用目前主要集中在基础研究、农业、疾病研究、药物开发这四个方面。此外。在司法鉴定、环境和食品检测等方面，蛋白质组学也有着广泛的应用。 4.1 在基础研究中的应用 近年来蛋白质组研究技术已被应用到生命科学基础研究的各个领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、动物和植物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如细胞分化、信号转导、蛋白质折叠等。这些基础性的研究可为应用研究的高速发展奠定扎实的基础。 目前，信号传导途径、蛋白质相互作用及其他分子间事件已成为日益重要的研究领域之一。对于细胞内蛋白质的相互作用以及信号传导机制的研究。可使人们逐步从分子水平了解生物体是如何运作的。如孟山都医院(Toronto)已开始进行大规模信号传导网络的研究。Uetz等通过大规模酵母双杂交技术对啤酒酵母近6000种蛋白质之间相互作用进行了全面研究。在细胞周期研究中，Bjorn等对新月柄杆菌生长周期蛋白图谱的比较，发现一个细胞周期中有48种蛋白降解，同时有26种生成。 4.2 在农业方面的应用 在农业方面，蛋白质组学的研究虽起步较晚，但进展迅速。新西兰曾利用蛋白质组技术做过牛奶的质量检验。Chang报道了玉米茎尖在缺氧状态和正常状态下蛋白质组图谱的差异情况。海松是欧洲西南部最重要的松树品种。当因风、雪等原因引起树干垂直方向发生变化时，树的底部会产生压缩木(compression wood，CW)以使树重新回到垂直方向。产生的CW引起细胞壁结构和化学改变，会导致木质的品质缺陷。Piomion等用2-DE方法研究了正常木与压缩木反应蛋白的区别，为及早发现CW 并采取预防措施提供了诊断标记。 4.3 在疾病研究中的应用 蛋白质组学在疾病研究中的应用主要是发现新的疾病标志物，鉴定疾病相关蛋白质作为早期临床诊断的工具，以及探索人类疾病的发病机制与治疗途径。这方面的研究发展较快，人类许多疾病如肿瘤、神经系统疾病、心脑血管疾病、感染性疾病等均已从蛋白质组学角度展开了深入研究，并已取得了一系列进展。 目前对疾病特别是肿瘤的早期标志蛋白分子(biomarker)的筛选已在世界范围内形成热潮。如 Chambers等对膀胱肿瘤细胞和尿道蛋白的大规模2DE后建立了膀胱恶性肿瘤数据库，并进一步建立了膀胱癌患者尿液中分泌性蛋白的数据库，得到一种鳞状细胞癌的候选诊断标志物psoriasin。国内，李江等通过脂质体转染把NGX6导人鼻咽癌细胞株中，再用2-DE分离细胞内所有蛋白质，找出与未处理细胞表达差异的蛋白质，鉴定出7种表达上调的蛋白质，如Fas蛋白、锌指蛋白和主要组织相容性抗原Ⅱ等。这些研究有望为肿瘤的早期诊断提供准确可靠的依据。 在神经系统疾病中，阿尔茨海默氏病(Alzheimers Disease，AD)是最常见的一种痴呆性疾病，严重危害老年人的健康。其实早在出现明显的认知障碍之前，大脑中就已发生了异常改变。Pasinetti等人利用cDNA微阵列发现AD病人大脑皮质某些基因产物的表达发生改变，后来，他们进行的一系列平行的高通量蛋白质组研究证实了这一结果，并发现突触活动中的蛋白质表达在AD早期也有改变。这项研究将有利于AD病人的早期诊断和治疗。 4.4 在药物开发方面的应用 蛋白质组学最大的应用前景在药物开发领域，不但能证实已有的药物靶点，进一步阐明药物作用的机制，发现新的药物作用位点和受体，还可用来进行药物毒理学分析及药物代谢产物的研究。 Muier CV等利用双向电泳和质谱技术，分析了布鲁氏杆菌的蛋白质组及其致病株16 M的蛋白表达模式，鉴定了所有表达的蛋白质，并对6种布鲁氏杆菌减毒疫苗Revl的蛋白图谱进行了广泛研究。这为发展疫苗，建立宿主专一性、进化相关性及药物开发奠定了基础。 Greenbaum等对疟原虫生长全周期的蛋白质组进行了全程定量跟踪研究，发现胱氨酸蛋白酶在侵入宿主细胞时期含量和活性都很高，进一步以该酶作为抑制靶标已筛选鉴定到了一批可以阻断疟原虫对宿主细胞感染的化合物。 蛋白质组学的研究不仅能为阐明生命活动规律提供物质基础，也能为探讨重大疾病的机理、疾病诊断、疾病防治和新药开发提供重要的理论依据和实际解决途径。 |
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