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honghaisyf木虫 (正式写手)
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[求助]
阿维菌素衍生化
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| 最近在做阿维菌素，想衍生化后用荧光测，但怎么都衍生不出来，我的衍生化是这样做的：在避光、室温环境条件下, 在装有0. 5mL乙腈溶解的待衍生化样品或标样的试管中, 先后分别加入0. 3mL乙腈、0. 1mLN甲基咪唑和0. 1mL三氟乙酸酐, 反应30min后, 往试管中再加1mL甲醇摇匀,反应60min后, 过0. 45m滤膜, 供HPLC-FLD测定. 不知哪里有问题，请高人指点！！！ |
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 我的实验 |
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yugijiang
木虫 (著名写手)
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honghaisyf: 金币+20, ★★★很有帮助 2012-08-10 11:21:40
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3.1 温度对衍生化反应的影响Rupp等[4]报道在50℃～55℃条件下，在15 min后才能反应完成；Yoshii等[5]认为在衍生反应前样品、标样和衍生反应试剂需冰水浴进行冷却；Wei等[3]认为在室温下15 min 反应产物量就能达到峰值。然而，本研究选择了在－20℃、0℃、20℃、40℃和60℃的５个不同温度下进行实验，发现5个处理间的结果之间无显著差异(见表1)，说明在－20℃～60℃内温度对衍生化反应没有显著影响（P<0.05）。因此，衍生化反应在室温下进行即可。另外，在实验中可观察到当衍生反应发生时，反应会出现大量放热的现象，反应溶液迅速达到较高的温度，这可能是温度对反应影响不显著的原因。 表1 温度对阿维菌素(5 mg/L)荧光衍生反应的影响（略） Table 1 Effect of temperature on fluorescence derivatization of abamectin 结果表示为平均值±标准偏差（resluts are presented as the mean±S.D) (n=4), P<0.05． 3.2 光照度对衍生化反应的影响Degroodt等[6]报道，如果在白天日光照射条件下，反应产物在3 h左右降解50％；Disens等[7]也发现衍生产生物对光线极其敏感；Wei等[3]的实验结果表明，在实验室内普通光线照射下或避光条件下试管中的荧光产物稳定。本实验将同一浓度的阿维菌素放置在光照度分别为0 Lux（黑暗环境中）、123.8 Lux、1665.5 Lux、11081.2 Lux的４个不同条件下进行３次重性性实验，发现在这４个不同光照度条件下所得的阿维菌素衍生产物峰值分别为1．86×１０６、1．55×１０６、０．78×１０６和０．25×１０６。由此说明，衍生反应受光照强度影响显著。光照度越大，越不利于衍生反应的进行。 3.3 光线对衍生化反应抑制作用机理研究光线对衍生化反应的抑制作用有两个可能：一是直接抑制反应过程，使反应产物的产量降低；二是不直接抑制反应过程，而是光线对阿维菌素或其反应产物快速光解，从而表现出对反应的抑制作用。本实验将１０ mg/L标准溶液分别设L1、L2、L3、L4 、L5 5种光辐照处理，其中L1在完全黑暗条件（0 Lux）下进行衍生化反应15 min后立即进样测定； L2在太阳光直射（7504 Lux）的条件下进行衍生化反应15 min后立即进样测定；L3在太阳光直射（7504 Lux）的条件下进行衍生化反应2 min后,将反应液转移至完全黑暗条件（0 Lux）放置13 min后进样测定；L4在完全黑暗条件（0 Lux）进行衍生化反应2 min后,将反应液转移在太阳光直射（7504 Lux）的条件下放置13 min后进样测定；L5在太阳光直射（7504 Lux）的条件光线照射2 min后，将标准溶液在完全黑暗条件（0 Lux）下进行衍生化反应13 min后进样测定。结果表明，L2 和L4的峰面积要远小于L1，而L3 和L5只是略小于L1（见图1），这说明光线对衍生化反应的抑制主要是由于衍生产物对光线极不稳定，易被快速光解。 图1 光线对阿维菌素荧光衍生反应作用机制（略） Fig.1 Mechanism of light effect on fluorescence derivatization of abamectin L1: 0 Lux×１５ min; L2: 7504 Lux×１５ min; L3: 7504 Lux×2 min＋０ Ｌux×１3 min; L4: 0 Lux×2 min+7504 Lux×１3 min; L5: 7504 Lux×２ min＋０ Ｌux×１3 min. 3.4 衍生试剂浓度对衍生反应的影响由于目前阿维菌素荧光衍生化方法大多采用de Montigny的NMIMTFAAACN法［２］,在实验中衍生试剂也多沿用了NMIMACN(1+1)和TFAAACN(1+2)的浓度和配比。本实验将同一浓度的标准溶液中加入不同释稀浓度的衍生试剂进行反应，每个浓度重复３次。结果发现，随时衍生试剂NMIMTFAA浓度（2.5％～25％）的升高，衍生产物峰值也增大，说明随时衍生试剂的增多，衍生反应越充分。但并非衍生试剂的浓度越高，衍生产物峰值就越高。相反，在高浓度(>30%)的衍生试剂下，衍生产物的峰面积开始下降，高浓度的衍生试剂表现对衍生反应有一定抑制作用，其作用机理有待进一步研究。 3.5 测定衍生反应速度及衍生反应产物稳定性de Montigny等[2]指出，NMIMTFAAACN法进行阿维菌素的衍生反应在室温条件下能瞬间完成（＜30 s）；Wei等[3]认为室温条件下反应15 min后达到峰值，随后逐渐下降，所以反应时间太长或太短都会影响反应结果；Roudaut指出[8],由于衍生产物易发生降解，衍生产物保存不应该超过6 h；Diserens等[7]认为衍生反应能在瞬间完成，衍生产物在常温下10 h内是稳定的，放置时间超过10 h时，衍生产物的峰值显著下降，而在4 ℃时保存24 h 没有表现出任何降解作用。在加入衍生试剂即时起，本实验定时地对衍生反应产物进行进样监测。结果表明，在加入衍生试剂后的30 min左右，衍生产物的峰值达到最大并趋于稳定,说明衍生反应并不是在瞬间能全部完成，而可能要持续到30 min才能反应完全。另外，衍生产物的峰值在室温（25℃）下8 h内无显著性变化，这结果与Diserens等观点一致。但在放置12 h后的衍生产物峰值有了显著下降，说明衍生产物在室温和避光条件下也不是很稳定的，衍生化的样品应该在衍生反应完全后尽早测定，样品不宜久放。 3.6 醇式衍生产物转换Rupp等[4]发现，阿维菌素在NMIMTFAAACN衍生反应体系的衍生产物是一个含4″三氟乙酰基的荧光衍生物（酯式），当它碰到水或醇类羟基物质时极不稳定，酯键易发生断裂，从而转化为稳定的醇式结构。这两种结构在HPLCFD上均有对应的色谱峰，其中醇式结构产物在C18的保留时间更短，出峰时间早。许多文献所报道的方法都是直接取衍生化反应液进样分析[4～10]。当酯式衍生产物与含水或甲醇的流动相接触后部分水解为醇式结构，并在色谱图上将多出现一个醇式结构产物的色谱峰，同时酯式衍生产物的峰值降低(图2)。而在进行目标峰积算峰值时，酯式衍生产物对应峰往往遗漏。因此，这样分析所得的结果要低于真实值，造成分析方法的准确度差。本实验在加入衍生反应完成后，再加入一定量甲醇并放置一定时间，使酯式结构产物全部转换为稳定的醇式结构。由图3可见，加入甲醇后放置30 min左右，反应液中的酯式结构能完全转换为醇式结构，在数据处理时只需对醇式结构产物的峰值进行积分就能准确测定阿维菌素量 |
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