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木虫 (正式写手)

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[求助] 定点突变试剂盒——长引物设计问题

不知大家是否遇到过我这样的问题：我目的要在质粒载体的某段序列前加8个氨基酸的序列，也就是24个碱基，我的方法是设计引物时放到引物里，想采用定点突变试剂盒扩增整个载体的同时，就把该24碱基插进去，下面出现问题：
1,引物中出现了4个连续相同的碱基，TTTTGCTTTTGGAAAACCTGCACC，（按大肠杆菌密码子偏好性设计的）不知这样可否勉强继续设计下去？
2,这样一来，再加上配对的碱基（14-18个），引物序过长，达到了47个碱基之多，Tm值80多度，这样下游引物不好设计（它们的Tm值差的太大），不知用定点突变试剂盒是否能PCR出来？在这谢谢大家的应助！

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