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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定点突变试剂盒——长引物设计问题
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ljsrzc

木虫 (正式写手)

喜欢海贼王喜欢娜美喜欢汉库克

[求助] 定点突变试剂盒——长引物设计问题

不知大家是否遇到过我这样的问题：我目的要在质粒载体的某段序列前加8个氨基酸的序列，也就是24个碱基，我的方法是设计引物时放到引物里，想采用定点突变试剂盒扩增整个载体的同时，就把该24碱基插进去，下面出现问题：
1,引物中出现了4个连续相同的碱基，TTTTGCTTTTGGAAAACCTGCACC，（按大肠杆菌密码子偏好性设计的）不知这样可否勉强继续设计下去？
2,这样一来，再加上配对的碱基（14-18个），引物序过长，达到了47个碱基之多，Tm值80多度，这样下游引物不好设计（它们的Tm值差的太大），不知用定点突变试剂盒是否能PCR出来？在这谢谢大家的应助！
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1楼 2012-07-25 15:11:27
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polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-25 20:05:45
ljsrzc: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 信你了哥们！ 2012-07-26 11:00:28
1,连续的4个碱基，不论是TTT还是AAA，在E.coli中的使用频率都高于40%,所以不会有影响。
2，长引物的问题，我们曾用过60个碱基的引物进行扩增都可以扩增出来，所以你的47个碱基也是没有问题的。
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
2楼2012-07-25 16:04:31
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