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黄芪活性组分与牛血清蛋白相互作用热力学分析中活性组分浓度怎样计算
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2楼2012-07-18 21:14:25
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第27 卷第6 期 2010 年6 月28 日 计算机与应用化李 C o m Pu ters an d A P P lied C h em istry Vo l.2 7 , N o .6 Ju ne, 20 10 黄芬活性组分与牛血清白蛋白相互作用的热力学分析 王新红, 戴兢陶 (江苏省滩涂生物资源与环境保护重点实验室, 江苏盐城师范学院化学化工学院, 江苏, 盐城, 224053) 摘要: 用荧光光谱和紫外可见吸收光谱法研究了在不同温度下, 中草药黄答的水提取液中的活性成分(R s) 与牛血清白蛋白(B SA ) 的相互作用的光谱行为, 试验发现, R S 对B SA 有较强的荧光碎灭作用..用st em 一Vo lme r 和Lin ew ea ve 卜B urk 方程分别处理试验数 据, 发现R S 与B SA 反应生成新的复合物且发生了分子内的非辐射能量转移, 属于是静态荧光碎灭类型, 并计算出不同温度下形成复 合物的形成常数KL B (28 K :4.538 x lo ..L mo l一,;308 K :34 8 x l0 ..L mo !一1)及对应温度下结合反应的热力学参数( ..丫一9 .71 kJ.. m ol.. ,; 八了二5 4 5/ 5 沸Z kJ ..m ol 一,: 么G 日~ 25 石8/ 一26 7 8 kJ ..m ol 一, ), 证明二者主要靠疏水作用力结合..这为了解中草药中的活性小分子与蛋白 质等生物大分子的弱相互作用提供有益的参考和依据.. 关键词: 黄答; 牛血清白蛋白; 荧光光谱; 紫外一可见光谱 中图分类号: 0 6573 9 文献标识码: B 文章编号: 100 1一4 160(20 10)06一827一529 引言 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白, 药物进入血浆后, 首先与血清白蛋白结合, 然后再被运 送到身体的各部位发挥药效..药物的吸收.. 分布.. 代谢 及排泄等直接影响到药物在其作用部位的浓度和有效浓 度的持续时间, 从而决定着药物作用(治疗作用和毒性 作用) 的发生.. 发展和消除..药物与蛋白质相互作用在 临床治疗以及药物的药效学和药动力学上的重要意义, 使得这一研究领域十分活跃[..一, ]..黄答R adix Seutellari ae (R S ), 化学成分非常复杂..前人等主要集中在黄答中的 某一成分的作用机理的研究, 而对黄答混合组分的研究 还未见报导, 因此本文利用紫外一荧光光谱对黄答提取液 的活性组分与B SA 的相互作用进行了研究, 判断了机理, 并计算了结合常数及热力学函数.. (PH 一7.4) 配制成1.0o x 10一, mo 卜L 一..储备液, 置于冰箱 1 .. 一4 .. 保存..黄答水提取液, 准确称取6. 00 9 黄答, 加水后, 在50 .. 下超声40 m in , 静置, 过滤后取滤液定 容至1 00 mL , 得为6. o o m g M I一..储备液, 得黄答水提 取液储备液..实验试剂均为分析纯, 实验用水为二次去 离子水(R 为16.S M 八) .. 2. 2 实验方法 移取浓度为1.00x 10一5 m ol. L 一..的纯B SA 溶液于1 cm 的石英比色皿.中, 使用微量进样器逐步往比色皿中注射 6.0 m g mL 一, 的黄答溶液, 每次注入量为10 L , 得到不同 浓度的R S一B SA 溶液体系, 在280 nm 的激发波长下, 扫 描荧光发射光谱.. 2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 L S 一50 B 型荧光分光光度计(美国Pe rk in一El m er 公 司);U V- V IS 9 16 型紫外可见分光光度计(澳大利亚G B C 公司); PH S一3C 型数字式酸度计.. B 一R 缓冲溶液: 0. 04 m ol. L一, 磷酸.. 乙酸.. 硼酸, 加 入适当的0. 2 m ol. L一, N a0 H 溶液调节pH 值..牛血清白蛋 白(B SA ) ( 国药集团上海分公司), 加入上述缓冲液 3 结果与讨论 3.1 黄荃活性成分对B SA 的荧光碎灭光谱 白蛋白分子中因含有色氨酸.. 酪氨酸等残基而发射 较强的内源荧光..由图1, 随着药物R S 的不断加入, B SA 能显著地碎灭B SA 的荧光, 且发射峰的峰形及峰位置不 变, 说明其与蛋白间形成了复合物[].. .. 3. 2 碎灭机理 分别测定了巧.. ..35 .. 时黄答活性成分对B SA 荧光 的碎灭图谱..引起荧光碎灭的原因主要为静态碎灭作用 和动态碎灭作用l5] ..如果黄苏活性成分对B SA 荧光的碎 灭机理是动态碎灭作用, 可用St em 一Vo lm e:方程进行描 述, 即: 收稿日期: 2009一11一13: 修回日期: 20 10一01一05 基金项目: 江苏省滩涂生物资源与环境保护重点实验室开放基金(JL C B E O6O26) : 江苏省高校自然科学基础研究项目(08 KJD 150020) 作者简介: 王新红, 女, 硕士, 讲师, 方向: 物理化学.. 联系人: ..三新红, Em ail:w an gxhong l227@ 163.eom 828 针算机与应用化学20 10 , 2 7(6) F0 /外l+凡..ro cQ = 1+Ks v.. cQ e os ..: 3 to x lo一6 m o l L一l, e Rs(l一s ): o , 0 .0 40力.0 50 , o 一2 , o一6 m g m L 人ex : 2 8 0 n m , slit: 10 m llz2 5 nrn (l) 线与B SA 一R S 体系的吸收光谱曲线相比发生明显的变 化, 由此更进一步可以判定该碎灭为静态碎火.. 对于静态碎灭作用, 可以用Li ne w ea ve r一B ur k 方程 描述, 即: l/(F0 一月= ]/F(j + l/(K LB ..F0 ..eQ) (2) 式中, 凡..为静态碎灭过程中复合物的形成常数lx] , 单位 是L .. m o一....女11果以(F0 一月..一eQ一..作L ine w eaver一B urk 双侄, 数曲线, 由直线的斜率可求出凡B ..回归方程见表l .. 表l 线性问少}方程与相关系数 Ta b le 1 R egr essio n eq u a tio n a nd e o r e latio n co e fi ele n t e urv e T/ K reg res sio n eq u a tio n R .冲月.n钊 \15|遥0 ..J\l一斗.. .-.-.一n讨0nU..Unn曰,.. 几U八Un曰nnUO八乙n咔月,工 一公明u.. l三产工的,二-一..F ig .1 F lu ore se en e e sP e etra o f th e sy ste m B S A 一R S - 图! B S A 一R S 体系的荧光光i普 式中F0 为未加入碎灭剂时荧光物质的荧光强度, F 为加入碎灭剂浓度等于cQ 时荧光物质的荧光强度, 凡为 碎灭过程的速率常数(L m ol 一....S一, ), 它反映了体系中分子 的彼此扩散和相互碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率 的影响, 各类碎灭剂对生物大分子的最大动态荧光碎灭 速率常数约为2.0 0火10 .... L m ol 一....S一..; 几为没有碎灭剂存 在下荧光分子的平均寿命, 生物大分子的荧光平均寿命 约为10 一..s; Ks V 称为st em 一vo lm e: 碎灭常数, 是碎灭速 率常数与单分子衰变速率常数的比率(L. m ol一..), 意味着 2 种衰变途径之间的竞争.. 以F0 /F~ cQ 作st em 一Vo lm er 自 线, 其直线的斜率rlJ 求出凡v和凡(表l) , 很明显, 凡 的数值大于最大动态荧光碎火速率常数[6] 约为 2.0 0 又10 .... L m ol 一....s一....所以, 可推断, 黄答活性成分对 B SA 荧光的碎灭机理是静态碎灭作用川.. 判断由于动态碎灭只影响到荧光分子的激发态, 因 而并不改变荧光物质的吸收光谱, 而在静态碎灭中, 基 于配合物的生成往往会导致荧光物质吸收光谱的改变, 由图2 的紫外吸收光谱分析, 表明加和后的吸收光谱曲 2 8 8 3 0 8 F0 /F= 65 829义104eQ+ 0.5758 F() /F= 45 639x 104e ..+ 0刀89 1 (F0 一月一..= 2.753x l0一..匆,+ l一9 16 (F0 一月....= 3 s82x 一..一seo一,+ 1.2909 0 .9 9 3 7 stern 一v o lm er 0 .9 9 7 2 L zn e w ea v e 卜 B u rk 2 8 8 3 0 8 0 .9 9 8 9 0 , 9 9 8 8 3. 3 黄荃活性成分与B SA 结合的热力学参数 荧光物质分子可以与溶剂分子或溶质分子之间发生 导致荧光强度下降的物理或化学作用19一....}, 这1现象被称 为荧光碎灭..热力学的观点认为, 在一定的温度和服力 下, 药物小分子与蛋白质大分子的结合反应能否自发进 行取决于体系的..G ..当温度变化不大时, 结合反应的 焙变..H 可看作常数, 由表l 所列数据, 以及热力学方 程式(3) .. 式(4) .. 式(5)可以求得的相关参数见表2 .. z,..l.. ..G 二一R 刀nK .了....j..伟,..口月 In (K 夕/K 尸)=( ..厅../R ) ..(l/不一l/兀) ..G = ..尸一T. A S 表2 结合作用的平衡常数和热力学参数 Ta b le 2 E q u ilib ri u m e o n sta nts an d the rm o d y n am ie P a ra m eters o f th e b ind in g re ae tio n . T /K 凡.. /(L .m ol ..尸 /(kJ..m ol一..) A G .. /(kJ..m ol.. ,) 3 .0 2 5 ..梦 /( J. m ol ...K .. ,) 任O 一 20 0 2 5() 3 00 350 40 0 4 5 0 又zn rll e os ..:3 .o x 一..一6 m o l土l e ..s:3 .o zllg m L 一I F ig .2 A b so rb a n e e sP e etra o f th e s y ste m B S A 一R S 图2 B SA 一R S 体系的吸收光潜 曲线l:R S :2:B S A ;3:R S 与B SA 代数不l}: 4 : R S 一B SA 2 8 8 4 万3 8 x l0 4 9 .7 1 2 5 .6 8 5 5 .4 5 3 0 8 3 .4 8 8 x l0 4 9 7 1 2 6 , 7 8 55 .4 2 从表2 可知, ..理< 0 , 证明该结合反应能自发进行; 反应的八尸< 0 , 说明结合过程为放热过程, 升高温度将 不利J几其向生成复合物的方向进行, 所以30 8 K 的结合 平衡常数小于28 K 时的....式衡常数..根据药物与蛋白质 间的作用力类型[l ..一..]规律, 即疏水力有可能使体系的AH 和..S 增大,氢键或者范德华力有可能使体系的..厅和..S 减小, 静电作用力使..刀之0, ..S> 0 ..由表2 数据判断, 可认为黄答活性成分与B SA 之间的结合作用力卞要以静 电作用力为主..随温度的增加, 结合嫡变减小, 说明结 合作用书要是由嫡引起的推动作用..另温度对结合常数 n曰 .. .. ..!l.. ..q七0u州月的.. 20 10, 27(6) 王新红, 等: 黄答活性组分与牛血清白蛋白相互作用的热力学分析82 9 影响很小, 进一步说明碎灭为静碎灭.. 10 R efe ren Ce S: 1 H e H u a , Yu jun sh en g a n d X u s h an P in g , et al. In tera etio n b etw e en P ro te in an d e iP ro fl o x ae in . 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I n v e stig a tio n o n th e in te r a e tio n o f th e e x tr a c t c o m P o n e n ts o f R a d ix S Cu tells 一ria eR S w ith B S A W a n g X in h o n g a n d D a iJ in g ta o (Jiangsu P ro vineialK ey Laboratory ofC oas怕lW e1la nd B io reso urc es and Environm enta lP of ect ion, C ollege ofC hem istry and C hem iealE ngineering, 粕neheng teaehers N orm alU nivers ity, Ya neheng, 2240:53, Jiangsu , C hina) A bstraet: The interaction betw een th e extr aet com Ponents ofR adix Seutellariae and bovine serum album in(B SA ) w as investigated usin g fl u oreseen ee an d U V /Vi s sPeetr op h otom etry . T he qu en ehing m eeh an ism w a, su g gested as statie qu eneh in g and the bind in g eonstan ts w ere determ ined at dife rent temP era tu res. A eeording to the therm ody xlam ie Param eters, the m aln blnding fo rce w as in v e stig a te d a s h y d ro P h o b ie fo rc e . 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3楼2012-07-24 21:10:04
