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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 超声破碎细胞
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xieqi316

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by shiliu2011 at 2012-06-26 15:02:29
不要一次做太多样品， 建议你分三次做， 每次做6管 ，先破碎完的可以放在冰上

谢谢！我明天正好做。
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11楼2012-06-26 16:24:01
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by xieqi316 at 2012-06-26 11:23:12
那一共超声多少次呢？...

我做的是诱导表达蛋白，超了100次
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12楼2012-06-26 18:23:10
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zhangzhilai

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2012-06-25 15:57:07
说的破碎15分钟应该是总的破碎时间吧，至于工作几秒停几秒你得根据自己实际情况确定，别间隔时间太短样品过热就行。15分钟时间长的话你可以分几个时间段破，分别取样镜检，找个破菌时间最短，破菌率效果比较好的时间 ...

请问，能不能告知镜检的具体做法？谢谢啦！
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13楼2013-05-10 15:26:06
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

破碎，本人还是有点小经验的，与你分享下吧！（我这个适合于大样品的处理，小样品的没试过）
a.超声破碎整个过程需要在冰水混合物的冰浴上进行！水不要多也不要太少！
b.破碎前，加少量溶菌酶和核酸酶。溶菌酶可以减少破菌时间，核酸酶可以水解核酸。还可以加点还原剂，如果你的半胱氨酸较多的话；也可以加点蛋白酶抑制剂！
c.超生破碎参数要设置恰当，一般间隙需要是超声的2倍，建议选择6s间隙，和3s破碎！如果样品量少于100ml，  建议500W超声20min，大概就行了！溶液就澄清了，不会那么粘！！！如果浑浊，但不粘，可能是包涵体！
d.破碎时，温度要控制好！过10min，搅拌一下样品，不要使样液温度很高，碰一下烧杯壁就能感觉到！如果温度高，那就先暂停一下，等温度降低，并且确保在冰浴中！或者改变超声参数，改为10s间隙，5s破碎，全程20~25min！
f.破碎完的蛋白离心之后要立即纯化，因为破碎后，样液中可能有许多蛋白酶，长时间放置会降解蛋白！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
14楼2013-05-10 22:54:47
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kedaxiaoyu

木虫 (职业作家)

神虫浮云

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by zhangzhilai at 2013-05-10 15:26:06
请问，能不能告知镜检的具体做法？谢谢啦！...

取一点样品（如果样品浓度太高可稀释一下）在一滴染色液里攒一下压片，显微镜下观察即可，破菌率至少得95%左右，当然接近100%更好。
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15楼2013-05-11 20:12:34
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zhangzhilai

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2013-05-11 20:12:34
取一点样品（如果样品浓度太高可稀释一下）在一滴染色液里攒一下压片，显微镜下观察即可，破菌率至少得95%左右，当然接近100%更好。...

多谢啦！
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16楼2013-05-12 17:02:39
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kedaxiaoyu

木虫 (职业作家)

神虫浮云

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by zhangzhilai at 2013-05-12 17:02:39
多谢啦！...

不好意思，之前和你说的不对，我刚咨询了一下我们专业做发酵的同事，他们是取一点样品（如果样品浓度太高可稀释一下）滴在载玻片干燥固定后，滴染色液染3-5分钟，后用水清洗染色液后烘干，滴香柏油在油镜下镜检就可以（40倍观察不用滴香柏油）。
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17楼2013-05-13 08:24:28
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zhangzhilai

金虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2013-05-13 08:24:28
不好意思，之前和你说的不对，我刚咨询了一下我们专业做发酵的同事，他们是取一点样品（如果样品浓度太高可稀释一下）滴在载玻片干燥固定后，滴染色液染3-5分钟，后用水清洗染色液后烘干，滴香柏油在油镜下镜检就可 ...

恩，好的，多谢啦！
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18楼2013-05-13 08:53:10
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springnamao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hhz0104 at 2012-06-25 18:56:01
工作3s，间歇10s，刚手快打错了

不会吧，那我们一直都没正规操作哦……我们都一下子超声好几分钟呢，中间都没停过
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生如夏花
19楼2013-05-13 10:04:34
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myprayer

专家顾问 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

我之前用过:工作十秒,间隔二十秒,总共十分钟.我们实验室的仪器说明书上就这样写的我们一直也就这样做的
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20楼2013-05-13 10:14:36
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