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xieqi316

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by shiliu2011 at 2012-06-26 15:02:29
不要一次做太多样品, 建议你分三次做, 每次做6管 ,先破碎完的可以放在冰上

谢谢!我明天正好做。
11楼2012-06-26 16:24:01
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by xieqi316 at 2012-06-26 11:23:12
那一共超声多少次呢?...

我做的是诱导表达蛋白,超了100次
12楼2012-06-26 18:23:10
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zhangzhilai

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2012-06-25 15:57:07
说的破碎15分钟应该是总的破碎时间吧,至于工作几秒停几秒你得根据自己实际情况确定,别间隔时间太短样品过热就行。15分钟时间长的话你可以分几个时间段破,分别取样镜检,找个破菌时间最短,破菌率效果比较好的时间 ...

请问,能不能告知镜检的具体做法?谢谢啦!
13楼2013-05-10 15:26:06
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

破碎,本人还是有点小经验的,与你分享下吧!(我这个适合于大样品的处理,小样品的没试过)
a.超声破碎整个过程需要在冰水混合物的冰浴上进行!水不要多也不要太少!
b.破碎前,加少量溶菌酶和核酸酶。溶菌酶可以减少破菌时间,核酸酶可以水解核酸。还可以加点还原剂,如果你的半胱氨酸较多的话;也可以加点蛋白酶抑制剂!
c.超生破碎参数要设置恰当,一般间隙需要是超声的2倍,建议选择6s间隙,和3s破碎!如果样品量少于100ml,  建议500W超声20min,大概就行了!溶液就澄清了,不会那么粘!!!如果浑浊,但不粘,可能是包涵体!
d.破碎时,温度要控制好!过10min,搅拌一下样品,不要使样液温度很高,碰一下烧杯壁就能感觉到!如果温度高,那就先暂停一下,等温度降低,并且确保在冰浴中!或者改变超声参数,改为10s间隙,5s破碎,全程20~25min!
f.破碎完的蛋白离心之后要立即纯化,因为破碎后,样液中可能有许多蛋白酶,长时间放置会降解蛋白!
长得比我英俊的,没我有才华!有才华的,没我长得俊!
14楼2013-05-10 22:54:47
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kedaxiaoyu

木虫 (职业作家)

神虫浮云

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by zhangzhilai at 2013-05-10 15:26:06
请问,能不能告知镜检的具体做法?谢谢啦!...

取一点样品(如果样品浓度太高可稀释一下)在一滴染色液里攒一下压片,显微镜下观察即可,破菌率至少得95%左右,当然接近100%更好。
15楼2013-05-11 20:12:34
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zhangzhilai

金虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2013-05-11 20:12:34
取一点样品(如果样品浓度太高可稀释一下)在一滴染色液里攒一下压片,显微镜下观察即可,破菌率至少得95%左右,当然接近100%更好。...

多谢啦!
16楼2013-05-12 17:02:39
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kedaxiaoyu

木虫 (职业作家)

神虫浮云

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by zhangzhilai at 2013-05-12 17:02:39
多谢啦!...

不好意思,之前和你说的不对,我刚咨询了一下我们专业做发酵的同事,他们是取一点样品(如果样品浓度太高可稀释一下)滴在载玻片干燥固定后,滴染色液染3-5分钟,后用水清洗染色液后烘干,滴香柏油在油镜下镜检就可以(40倍观察不用滴香柏油)。
17楼2013-05-13 08:24:28
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zhangzhilai

金虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2013-05-13 08:24:28
不好意思,之前和你说的不对,我刚咨询了一下我们专业做发酵的同事,他们是取一点样品(如果样品浓度太高可稀释一下)滴在载玻片干燥固定后,滴染色液染3-5分钟,后用水清洗染色液后烘干,滴香柏油在油镜下镜检就可 ...

恩,好的,多谢啦!
18楼2013-05-13 08:53:10
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springnamao

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by hhz0104 at 2012-06-25 18:56:01
工作3s,间歇10s,刚手快打错了

不会吧,那我们一直都没正规操作哦……我们都一下子超声好几分钟呢,中间都没停过
生如夏花
19楼2013-05-13 10:04:34
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myprayer

专家顾问 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

我之前用过:工作十秒,间隔二十秒,总共十分钟.我们实验室的仪器说明书上就这样写的我们一直也就这样做的
20楼2013-05-13 10:14:36
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