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beingking至尊木虫 (著名写手)
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质粒DNA提取实验常见问题解答
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１.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在 离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。解决方法：将细菌的用量增加。 2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？ （1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。解决方法：将细菌用量减半。 （2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。解决方法：注意将细菌悬浮充分。 （3）加Solution III后中和不充分。解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。 （4）Solution II出现沉淀。解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。 （5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代 Solution II使用。 3.出现严重的RNA污染？ （1）未在Solution I中事先加入RNase A1。解决方法：补加RNase A1。 （2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。 （3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在 Solution I中的浓度。 4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？ （1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。解决方法：使用新鲜培养的细菌。 （2）宿主菌富含核酸内切酶。解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。或者将质粒DNA进行乙醇沉淀。 （3）质粒DNA在Solution II中暴露过久，易造成质粒DNA的切口断裂。裂解步骤控制5分钟内完成。 （4）培养的细菌被杂菌污染。解决方法：重新挑取单菌落培养细菌。 5.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现基因组DNA的污染？ （1）菌体裂解和中和过程中,剧烈混合造成基因组DNA断裂所致。解决方法：温和地进行菌体的裂解和中和。 （2）加Solution II时操作时间过长，造成基因组DNA断裂所致。解决方法：将裂解步骤控制在5分钟内完成。 （3）细菌的质量差（反复冻融的细菌，陈旧的细菌，培养条件不合适的细菌等）中有许多断裂或降解而游离的基因组DNA，使用生长良好的新鲜细菌。 6.加样时DNA飘出加样孔外？ 忽略或省略了高速离心以甩干残留的Rinse B的操作步骤。解决方法：按说明书的操作步骤操作以确保残留的Rinse B被甩干。 7.为什么提出的质粒的多是二聚体和多聚体形式？ 是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。 8.质粒为何会丢失？ 细菌培养不要超过16小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 |
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