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qiulilf金虫 (小有名气)
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真菌DNA的提取
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真菌细胞DNA的提取: 菌种的培养与收集： 酵母菌在沙堡培养基上培养18~24h后，取1~2个菌落接种于6mL沙堡液体培养基中，室温下190r/min振荡培养48h. 3000×g离心10min,集菌，用无菌生理盐水洗涤菌细胞2次。曲霉，镰刀菌和青霉等在PDA培养基上30℃培养24h后， 转至室温下继续培养2周， 用0.0125%吐温20生理盐水冲洗斜面以获得菌细胞，3000×g离心10min,集菌，用无菌生理盐水洗涤菌细胞2遍。用细胞计数板将每一菌种浓度调至3.0×109菌细胞/mL,取4mL菌细胞悬浮液离心,弃上清夜,菌细胞沉淀层转移至1.5mL已知质量的EP管中,用电子天平称其质量,-20℃保存备用. 1.尿素裂解法:将保存的菌细胞悬于1mL尿素裂解液中(尿素8 mol/L,NaCl 0.5 mol/L,Tris 20 mmol/L,EDTA 20 mmol/L,2%SDS;PH:8.0),在室温下孵育3h.DNA的提取参照<<分子科隆指南>>.另外将等量菌细胞沉淀置于1mL尿素裂解液中置室温下24h,1个月,3个月,5个月,6个月,分别提取DNA 2.研磨+十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法:将菌细胞沉淀转移至一高压灭菌,预冷的研钵中,用液氮冷冻后,研磨成细末,移入EP管中.用1%CTAB提取液(1%CTAB,1.4mol/L NaCl,10mmol/LTris PH:8.0,20 mmol/LEDTA )600μL冲洗研钵和研棒,并重悬研磨的菌细胞,冰浴1h, DNA提取方法同上. 3.超声裂解法:菌细胞沉淀用500μL裂解液重悬(0.5mol/L EDTA,1mol/L Tris-HCl, 0.3%SDS;PH 8.0)超声处理30s,念珠菌,曲霉及青霉等处理2次,隐球菌处理4次,在处理期间,样品置于冰上10min,DNA提取方法同上. [search]真菌DNA的提取[/search] |
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