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iamkitty_1984铁虫 (初入文坛)
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[交流]
冰冻切片
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有谁知道冰冻切片的制作步骤（是从制作冰冻切片开始一直到后面的免疫组化步骤结束，因为我不知道冰冻切片是不是跟普通的石蜡切片免疫组化步骤一样),帮帮忙，谢谢！ [search]冰冻切片[/search] |
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asr(金币+2):Thanks!
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请参考 冰冻切片：15微米的切片，恒温切片机温箱温度须调到-20度。切片贴于玻片后，先在室温下自然干燥（1-2小时），然后可进冷丙酮或醋酸-乙醇（Clarke改良剂，100%乙醇95毫升、冰醋酸5毫升）,然后按免疫组化染色操作进行。 若不染色，须吹干后储存于低温冰箱内（-20度）或经短暂预固定后（2%多聚甲醛的0.1mol/lPBS PH=7.4）储存于冰箱保存。 冰冻切片ABC法步骤 1) 吹干切片或晾干 2) 浸4度冷丙酮10分钟 1 洗切片 PBS/Triton 10分钟 2 2％双氧水（溶于PBS）孵育10－30分钟 3洗切片 PBS/Triton 3X5分钟 4 加封闭液10%羊血清（PBS/Triton）30-60分钟，100-400ul 5 一抗(1:400或1:1000)（溶于10%的羊血清），4度过夜，100-400ul 6洗切片 PBS/Triton 3X5分钟 7 加生物素化二抗(1:200)（溶于10%的羊血清），室温60分，100-400ul 8 准备ABC试剂，室温下15分钟 9洗切片 PBS/Triton 3X10分钟 10 ABC孵育切片30-60分钟 11洗切片 PBS/Triton 3X10分钟 12 DAB孵育切片5分钟，100-400ul 13洗切片，PBS 3X5分钟 14 苏木素衬染10秒 15洗切片，PBS 2X5分钟 16 脱水50%（2分）、70%（2分）、95%（2分）、100%（2分）乙醇 17 透明二甲苯/乙醇（2分）、100%二甲苯（5分） 18 中性树脂封片（用纱布擦净二甲苯） 溶剂配方： PBS/Triton: 99.8mlPBS+0.2mlTriton-X100 封闭液（稀释液）：3滴羊血清（黄瓶）+10毫升（PBS/Triton）在黄色瓶中混合。 一抗(1:400) 50ul与20毫升稀释液混合 即5ul:2ml(2ul:0.8ml) 二抗（1:200）50ul与10毫升稀释液在蓝瓶中混合，即5ul:1ml(2ul:0.4ml) ABC 2滴A至10毫升 PBS/Triton+2滴B，混匀，30分钟后使用 DAB 5毫升蒸馏水+2滴buffer stock solution，混匀，再加4滴DAB，混匀，加2滴H2O2（30%）混匀。 1%H2O2： 1ml30%H2O2溶于PBS，终体积至30毫升 TBS ： 800毫升蒸馏水，8克NaCl，0.2克KCl，3克Tris碱，用HCL调至PH为7.4，用蒸馏水定容至1升，15磅高压消毒20分钟。 |
2楼2007-04-24 10:29:16