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DNA荧光原位杂交（FISH）简要综述
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DNA荧光原位杂交（FISH）技术是70年代末80年代初开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术，它的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记（如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP），然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。利用FISH进行DNA序列的定位具有实验周期短、灵敏度高、分辨率高、直观可见等优点。 总的说来，FISH技术的发展沿着两条路线前进：一方面是采用不同的探针，从而衍生出许多FISH新技术，如Muticolor-FISH、CGH、GISH、CISS、BAC-FISH、Chromosome Painting、Rreverse Chromosome Painting等等；另一方面则是努力提高FISH技术的分辨率，将靶目标从中期染色体发展到DNA纤维，使其分辨率由1Mb发展到1kb,这更进一步拓展了FISH技术的应用领域，成为分子细胞遗传学的一项代表技术。 A．不同探针的应用： 1． 以基因组为探针的GISH技术可以定位外源DNA片段在染色体上的位置、大小、插入点等。Durnam（1985）首先将GISH应用于体细胞杂种的异源染色体检测。本实验室采用GISH方法在小麦中成功定位了许多外源染色体、染色体片段以及染色体结构变异。 2． 以不同的荧光素标记探针的Muticolor-FISH，可以同时定位不同探针序列的分布。1990年Nederlof等创建了多色荧光原位杂交技术。他们用生物素、AAF（氨基乙酰荧光素）和CP三种半抗原对不同探针作单、双、三标记，再用这三种半抗原相应的分别标记了异硫氰酸荧光素（FITC，绿色）、氨甲香豆素乙酸（AMCA，蓝色）和碱性蕊香红（TRITC，红色）的抗体来检测荧光，该技术最多可同时观察7个靶染色体。 3． 以正常基因组DNA与异常基因组DNA混合为探针，以正常中期染色体为靶目标的CGH技术可以根据两种探针信号的强度差异找出基因组中DNA增加或缺失区域。目前CGH在实体瘤研究中得到了最先和最广泛的应用，如小细胞癌、乳癌、神经胶质癌、膀胱癌和前列腺癌等。 4． 以单一染色体文库为探针，以异常染色体为靶目标的染色体涂色（Chromosome Painting）技术特别适合于检出染色体多体和易位。 5． 以显微分离的异常染色体区段为探针，以正常染色体为靶目标的反向染色体涂色技术（Reverse Chromosome Painting）可以确定异常染色体区段的来源。 6． 以BAC、YAC、cosmid文库为探针，可以同时对多个文库克隆进行定位、定序。1995年Jiang等运用BAC-FISH首次将Xa-21成功定位到染色体上。1997年，Nakamura等构建与Pi-ta2连锁的800kb的BAC连接群，通过BAC-FISH将Pi-ta2定位在水稻的12号染色体的近着丝粒区域中 7． 直接在靶DNA上以探针为引物进行原位合成的引物原位DNA合成技术（primed in situ DNA synthesis,PRINS）和原位PCR技术（PCR in situ）提高了原位杂交的效率和检测的灵敏度。前者是由Koch等人1989年建立的，将重复序列α-卫星DNA定位到了人类染色体上。 B．分辨率的提高： 为了更精确地进行DNA序列定位，必须努力提高FISH技术的分辨率。它的分辨率是指两个不同DNA探针能够被检测到的最小距离。在决定FISH分辨率的因素中，最重要的是所使用的靶DNA在染色体或DNA纤维上的浓缩度（condensation）,亦即DNA在染色体结构或DNA纤维上的三维空间包裹程度，浓缩度越高，分辨率越低。 1． 早期的FISH多以中期染色体作为靶DNA的载体，它有制片容易，可保持染色体结构的优点，但它的分辨率只有1~3Mb。 2． 为了得到浓缩度低的染色体作为靶DNA的载体，Inazawa等（1994）、Haaf和Ward(1994)分别采用了有丝分裂前期染色体及用离心机械力拉长的中期染色体，将分辨率提高到200kb左右，但制片困难，提高分辨率的能力有限。 3． Albini等（1992）在黑麦粗线期染色体上成功地进行了两个重复序列的定位研究。Zhong等（1996）采用番茄的减数分裂粗线期染色体作为靶目标，进行了DNA单一序列的定位研究，使分辨率水平达到100kb，但制片有一定难度。 4． Lawrence等（1988）观察到再见其细胞核中两个探针的实际距离与再见其细胞核上的荧光原位杂交信号的距离有一定的相关性。分辨率可达50kb，但这种相关性在超过2Mb之后相应减弱。 5． 为了突破FISH分辨率的限制，须考虑人为改变染色质的原有空间结构。Heng等（1992）用碱性溶胞剂（alkaline lysis buffer）对处于G1和G2期之间的间其细胞核进行处理，释放出游离的染色质丝（free chromatin），其FISH分辨率水平接近10kb。 6． 游离染色质丝尽管已经失去了原有的细胞空间结构，但它仍是DNA和蛋白质的复合大分子。在Heng等（1992）的思路的基础上，Wiegant(1992),Windle(1993)进一步想到用更强的变性剂对染色质丝进行处理，让DNA分子完全从蛋白质中分离出DNA纤维（extended DNA fiber）。通过含高盐的碱性变性剂处理间期的细胞核（wiegant,1992）、游离的单细胞培养液（Parra and Windle,1993）或提出的细胞核（zhong,1996;Scott,1998）,或用PFGE分离大分子DNA制备出的DNA纤维，其DNA 伸展度都可使FISH分辨率达到1kb甚至更低。这种高分辨率的fiber-FISH在应用上有其独到的优势，如 分析重叠克隆群（Heiskanen,1994）、检测染色体重排（Heiskanen,1995）、判断基因间距离和基因长度（Heiskanen,1995）、测量长DNA位点的大小（Shiels,1997）并最终加速图位克隆（Laan,1996）。在某些情况下，fiber-FISH几乎是必不可少的工具，如当进行BAC重叠克隆群的组装时，由于重复序列的存在、在某些区域没有有效的BAC文库或由于低重组率而没有足够的DNA标记时，将会在物理图谱上形成gap，几乎在所有的重叠克隆群的报告中都存在这样的gap，利用fiber-FISH可以快速地估算出gap的大小。Fransz等（1996）通过fiber-FISH在拟南芥上进行了高分辨率物理作图，分析了包含3个cosmid的contig，覆盖89kb长的基因组片段。这种方法结合了多色FISH，分辨率达0.7kb。 |
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