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细胞培养基本技术概述中无菌操作基本技术
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无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每 次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间 污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间 隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可 以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦 拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操 作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用， 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程 中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐 针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌 制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干 净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于 oven 中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170 oC, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高 压灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟处理。 培养基 1. 液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳， 可以再添加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合， 然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生 长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。 3.2. 材料： 3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) 3.2.2. 粉末培养基 3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019) 3.2.4. 电磁搅拌器 3.2.5. 无菌血清瓶 3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 3.2.7. pH meter 3.2.8. 真空帮浦 3.2.9. CO2 气体 3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后 溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。 若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时， pH 会升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养 基种类、日期、瓶号等，贮存于4 oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤) 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 4. 配制培养基之生长测试 4.1. 材料： 4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) 4.1.3. methanol 4.1.4. glacial acetic acid 4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 4.2. 步骤： 4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35 mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。 4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群 落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 4.2.3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静 置10 min。 4.2.4. 去除固定液，水洗二次。 4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。 4.2.6. 去除染液，水洗二次。 4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不 佳，则丢弃之。 抗生素 1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待 token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。 4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。 5. 抗生素使用种类与浓度： 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds 血清 1. 血清必须贮存于–20 ～ -70 oC，若存放于4 oC，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加 入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇 晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20 oC 直接 至37 oC 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均 匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建 议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿将血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。 6. 血清之沈淀物 6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性 及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本 身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上 清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会 阻塞过滤膜。 6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。 有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清 放在37 oC 中欲培养此“微生物“，但在37 oC 环境下，又会使此沈淀物增多，更 会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此 小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批 号的血清。 7. 血清之生长测试 7.1. 材料： 7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish) 7.1.4. methanol 7.1.5. glacial acetic acid 7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 7.2. 步骤： 7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80 % confluency。 7.2.2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细 胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102 活 细胞数/ ml。 7.2.3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血 清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10 % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。 7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大 到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。 7.2.5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静 置10 min。 7.2.6. 去除固定液，水洗二次。 7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。 7.2.8. 去除染液，水洗二次。 7.2.9. 以肉眼计数群落数 7.2.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 7.2.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 % 7.3. 比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。 7.4. 订购多量同一批号的优良血清，置于–70 oC 保存之 冷冻细胞活化 1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死 亡。 2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生 单株抗体或是其它蛋白质)。 3. 材料 3.1 37 oC 恒温水槽 3.2 新鲜培养基 3.3 无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶 3.4 液氮或干冰容器 4. 步骤： 4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时 盖子易松掉。 4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无 菌操作台内。 4.4 取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全 部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为 1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作 存活测试。 4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol)，依细胞种类而异， 一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞 悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清 液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。 4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。 细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞 种类而异。 2. 材料： 2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽 回温。 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤： 3.1. 附着型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉旧培养液。 3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。 3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 oC 作用数分钟，于倒 立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清 之新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。) 3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数 次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常 培养条件培养。 3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的 培养瓶中，以正常培养条件培养。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可 能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基 稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。 细胞计数与存活测试 1. 原理： 1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。 1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形， 其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方 盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计 数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞 数目。 1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细 胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细 胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。 2. 材料： 2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.2. Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline 2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip) 2.4. 计数器(counter) 2.5. 低倍倒立显微镜 2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 步骤： 3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于 1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于 100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。 3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue 等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml *每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。 3.5. 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之 细胞数目。 活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59 死细胞数/方格：5, 3, 4, 6 细胞总数= 243 平均细胞数/方格= 60.75 稀释倍数= 2 细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/243﹦92.6 % 喜欢就要顶起！  |
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