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荧光分析方法的最新进展
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当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色，在17世纪，Boyle（1626—1691）和Newton（1624—1727）等著名科学家再次观察到荧光现象，并且给予更详细的描述。尽管在17世纪和18世纪中还发现了其它一些发荧光的材料和溶液，然而在解释荧光现象方面却几乎没有什么进展。直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。Stokes还对荧光强度与浓度之间的关系进行了研究，描述了在高浓度时以及外来物质存在时的荧光猝灭现象。此外，他似乎还是第一个（1864年）提出应用荧光作为分析手段的人。1867年，Goppelsröder）进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则，到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600种以上的荧光化合物。 20世纪以来，荧光现象被研究得更多了。例如，1905年Wood发现了共振荧光；1914年Frank和Hertz利用电子冲击发光进行定量研究；1922年Frank和Cario发现了增感荧光；1924年Wawillous进行了荧光产率的绝对测定；1926年Gaviola进行了荧光寿命的直接测定等等。 荧光分析方法的发展，与仪器应用的发展是分不开的。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。 近十几年来，在其它学科迅速发展的影响下，随着激光、微处理机和电子学的新成就等一些新的科学技术的引入，大大推动了荧光分析法在理论方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法、新技术的发展，并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药卫生、环境保护、公安情报和科学研究等各个领域中。如今，荧光分析法已经发展成为一种重要且有效的光谱化学分析手段。 在我国，50年代初期仅有极少数的分析化学工作者从事荧光分析方面的研究工作，但到了70年代后期，荧光分析法已引起国内分析界的广泛重视，在全国众多的分析化学工作者中，已逐步形成一支从事这一领域工作的队伍。近年来，国内发表的有关荧光分析方面的论文数量增长较快，所涉及的内容也已从经典的荧光分析法逐步扩展到新近发展起来的一些新方法和新技术，在仪器应用方面也陆续有几种类型的国产的荧光分析光度计问世，为这一分析方法的发展和普及提供了一定的物质条件。 时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA）是近十年发展起来的一测微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析的利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度的提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。 解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1－2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。 平时常用的稀土金属主要是Eu(铕）和Tb(铽），Eu荧光寿命1ms,在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。 由于常用Eu作为荧光标记，因此增强剂就成了试剂中的重要组成。增强剂原理：利用含络合剂、表面活性剂的溶液的亲水和亲脂性同时存在，使Eu在水中处于稳定状态。现在有些试剂，在络合Eu在抗体上时已考虑了增强问题，而使用了具有增强作用的新络合剂，因而有的试剂没有单独的增强剂。 随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法（TRFIA）具有越来越大的应用空间。 时间分辨荧光分析足以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的超灵敏度检测技术，它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点。使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程砷。 标记物 采用镧系元素（铕、钐、镝、铽）进行原子标记，较碱性磷酸酶、吖啶酯、生物素等大分子标记物优势明显： 原子标记，标记物更多，检测更灵敏，对被标记物的生物活性和结构无影响原子标记， 标记稳定性强。 多种标记，一个测试，多个项目。 标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光谱峰范围窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。 激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移，有利于排除特异荧光的干扰，增强测量 的特异性。 标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。没一秒钟检测样品1000次，结果取平均值，有利于提高检测的准确性。 检测参数 灵敏度： 10-18 mol/well(Eu3+) 线性度： 10-18 ~ 10-12 mol/well(Eu3+) 某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。物质的 激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶 剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度 成正比关系，可以用作定量分析。荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法为高，浓度太大的溶液会有“自熄灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。 用荧光分析法分析的仪器，称为荧光分光光度计。 按各药品项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并配制对照品溶液和供试品溶液。 由于不易测定绝对荧光强度，故荧光分析法都是在一定条件下，用对照品溶液测定 荧光强度与浓度的线性范围后，再在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校定仪器的 灵敏度；然后在相同的条件下，分别读取对照品溶液及其试剂空白的荧光读数与供试品 溶液及其试剂空白的荧光读数，用下式计算供试品浓度： R<>-R<[ib]> C<>＝──────———×C<[r]> R<[r]>－R<[rb]> 式中 C<>为供试品溶液的浓度； C<[r]>为对照品溶液的浓度； R<>为供试品溶液的荧光读数； R<[ib]>为供试品溶液试剂空白的荧光读数； R<[r]>为对照品溶液的荧光读数； R<[rb]>为对照品溶液试剂空白的荧光读数。 因荧光分析法中的浓度与读数的线性较窄，故(R<>－R<[ib]>  /(R<[r]>－R<[rb]> 应为0.50～2.0；如有超过，应在调节溶液浓度后再测。对易被光分解的品种，为使仪器灵敏度定标准确，避免因激发光多次照射而影响荧 光强度，可选择一种激发光和发射光波长与之近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶 液，作为基准溶液，例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素 钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液等,在测定供试品溶液时用基准溶液代替对照品 溶液校定仪器的灵敏度。 荧光分析法因灵敏度高，故干扰因素也多。溶剂不纯会带入较大误差，应先作空白 检查，必要时，应用玻璃磨口蒸馏器蒸馏后再用。溶液中的悬浮物对光有散射作用，必 要时，应用垂熔玻璃滤器滤过或用离心法除去。所用的玻璃仪器与测定池等也必须保持 高度洁净。温度对荧光强度有较大的影响，测定时应控制温度一致。溶液中的溶氧有降 低荧光作用，必要时可在测定前通入惰性气体除氧。 荧光分析法具有灵敏度高（比紫外、可见分光光度法高2ˇ3个数量级），能提供激光光谱、发射光谱、发射强度、特征峰值等信息，在生物、环保、医学、药物、石油勘探等诸多领域都有广泛的应用。本仪器不能直接、间接地分析众多的有机化合物；另外，还可利用有机试剂间的反应，进行近70种无机元素的荧光分析。荧光的光谱特征是荧光光谱总是滞后于激光光谱即斯托克斯位移。 |
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