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haishuiyiyi金虫 (著名写手)
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求助免疫共沉淀中蛋白A与蛋白G的区别。 [ Last edited by haishuiyiyi on 2007-3-12 at 20:06 ] |
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免疫共沉淀原理及实验方法 免疫共沉淀 一 原理： IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。 其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。 再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。 每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。 二 准备： 器械 #微量高速冷冻离心机 #移液枪 #旋转盘 #电泳设备 #vortex震荡器 #液氮及组织粉碎器 #eppentube 试剂 #细胞或组织 #蛋白定量kit #SDS电泳试剂 #抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清) #PBS #NaN3 #proteinA sapharose 试剂配制 抗原蛋白溶解缓冲液 1.RIPA缓冲液 (最终浓度) 1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM) 0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%) TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml 另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水) 2.NP40 lysis 缓冲液 1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM) 0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%) TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 450ml toal 500ml 使用前加1mM的PMSF 注意点： *Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。 *反复使用PMSF要注意保管方法。 *1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC Protocol 1 调制protein A sapharose protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS 离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存 用单抗做一抗时，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s 去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次 加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。避免长期保存。 2．抗原的检出 以下操作全在冰面或4度进行 去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量：6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。 30m，15000rpm离心，上清转移到新tube 。不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube 往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h 加protein A sapharose50ul，再混匀1h 5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混匀，离心，去上清。重复4次洗净。 加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。 3.注意点 A：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。 B：对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完) |
2楼2007-03-17 18:32:51