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biolyc

铁虫 (初入文坛)


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你利用PCR的方法去扩增5-6k的质粒,原则上来讲是不太好的,因为pcr扩增大片段会产生突变,即使是一个碱基的突变,有可能你的质粒就可能不能用了。我们进行质粒的定点突变,为了降低PCR后可能引入的突变,利用PCR的方法,扩增的循环数也是很低的20个循环左右,远远达不到你要求的50ng/ug,这就是为什么没有人用PCR的方法来提高质粒浓度。因此建议你用加大菌量的方法来提高质粒浓度!
RCN3
11楼2012-02-23 15:23:52
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
用高保真PCR酶扩增,高效率连接酶连接,最好选择一个酶切位点,扩出来酶切后黏性末端连接效率也高些,不过这些都只是理论上的,估计结果不会很理想。
可能你的质粒所在的载体菌种是低拷贝,建议直接抽提质粒重新转化到DH5a中,再抽质粒,如果还不行就做个大抽,然后浓缩质粒,相信可以达到你要求的浓度,这个方法会更靠谱些
12楼2012-02-24 14:05:40
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