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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR扩增法制备低拷贝质粒（替代常规质粒提取）
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biolyc

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你利用PCR的方法去扩增5-6k的质粒，原则上来讲是不太好的，因为pcr扩增大片段会产生突变，即使是一个碱基的突变，有可能你的质粒就可能不能用了。我们进行质粒的定点突变，为了降低PCR后可能引入的突变，利用PCR的方法，扩增的循环数也是很低的20个循环左右，远远达不到你要求的50ng/ug，这就是为什么没有人用PCR的方法来提高质粒浓度。因此建议你用加大菌量的方法来提高质粒浓度！
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RCN3
11楼2012-02-23 15:23:52
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
用高保真PCR酶扩增，高效率连接酶连接，最好选择一个酶切位点，扩出来酶切后黏性末端连接效率也高些，不过这些都只是理论上的，估计结果不会很理想。
可能你的质粒所在的载体菌种是低拷贝，建议直接抽提质粒重新转化到DH5a中，再抽质粒，如果还不行就做个大抽，然后浓缩质粒，相信可以达到你要求的浓度，这个方法会更靠谱些
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12楼2012-02-24 14:05:40
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