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（转载）制备色谱技术与操作及实验经验
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制备色谱技术与操作及实验经验 1 制备色谱到底是什么？ （1）分析色谱的目的，是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。制备色谱的目的， 是从混合物中得到纯物质。 为了加快分离的时间与提高分离的效率，制备色谱的的进样品量很大，导致制备色谱柱子的 分离负荷的相应加大，也就必须加大色谱柱填料，增大制备色谱的直径和长度，使用的相对多 的流动相。 然而，当色谱柱上样品负载加大的时候，往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色 谱，要解决容量与柱子效果之间的矛盾，对重现性也要考虑。从经济上来说。制备色谱要争取 少用填料，少用溶剂，要尽可能多的得到产品。 （2）样品的前处理： 制备色谱柱子由于处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前处理就显得非 常的必要。萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦， 就要尽可能多的采用以去掉杂质。 （3）制备色谱柱的材质及其特点 下面介绍一下，制备色谱柱常用的材质及其特点。 各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到，而且价格低廉，但玻璃柱子致命的弱点是它 能承受的压力很小，且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候，高位液 面或加高压空气（或者氮气）的采用是一个简单的解决办法。在底下加真空，也能在一定程度 上解决这个问题。 不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能，但其价格相对很贵。如果，只有很小的分离任 务且经费也允许，市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。 有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀，相对不锈钢柱子而言，它是半透明的，可以看到液体的运 行状态，对有色的物质其特点就更为突出。 （4）固定相的选择 硅胶、键合固定相（如C18）、离子交换树脂 、聚酰胺、 氧化铝、 凝胶等都可以作为色谱 柱的填料。 有不少文献报道，对填料可以进行一下处理提高了分离效果，如，对硅胶进行的 硝酸银（或缓冲液）处理。 （5）装柱方法的选择：根据固定相颗粒度和柱子的尺寸，采用不同的装柱方法，往往装填越 好分离效果越好。装柱效果跟填料的颗粒度关系很大，颗粒度的减少会导致装柱的难度。一般 来说，颗粒直径小于20－30um的固定相采用湿法装填。所谓“敲击－装填”技术适用于颗粒直 径大于25um的固定相。湿法的目的是迫使相对稀松的 固定相悬浆以高速装入色谱柱子，从 而减少空隙的形成。然而，当柱直径大于20mm，所加压力为30－40bar时，高压悬浆装填技 术就变得十分复杂。为将小颗粒固定相装入更大得制备型色谱柱，可采用柱长压缩技术。这种 方法，先将固定相悬浆（或偶尔是干填充物）装入柱中加压，利用物理方法将其压紧。压紧的 方法有两种：径向压缩和轴向压缩。 湿法装柱需要一定的设备，在柱子填完后，应用有柱效 的测量，对柱效低的柱子应该重填。 （6）流动相的选择 除了和分析色谱同样的考虑外，在选用流动相时，要考虑色谱分离后面加有旋转蒸发等二次 分离操作。一般来说，不宜采用高毒性溶剂，对多元溶剂要尽可能的少用。 如果产品中含有大量溶剂，溶剂的纯度也要考虑在其中。 （7）加样的方法 可以采用以下方法之一进样。－用注射器进样－用旋转阀进样－通过六通阀进样－通过主泵 进样－通过辅泵进样－固体上样 （8） 泵的选用 生产制备色谱泵的厂商很多。根据有无脉冲、能承受的最大压力、控制的精度、售后服务等 来选择泵。 （9）检测器的选用 一般的分析池的最大允许流速仅为5 mL/min 或者10mL/min。而专门的制备池的最大允许 流速可为150mL/min。有时，采用旁路分离管，将少量流体导入分析池进行检测，是一个不错 的办法，但其浓度的误差会相对较大。 （10）组分保留时间的估计 用分析柱子在同等色谱条件下（同样的固定相和流动相）测定保留时间后，按照单一组分的 线流速（不是体积流速）一定，通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。 分析谱图的峰形状，对确定保留时间也有很大的参考价值。 （11）产品的收集 手工馏分收集费时费力，自动馏分收集器有很大的方便。许多实验室和工厂都采用了馏分收 集器。 （12）超载、边缘切割、中心切割、放大技术与非线性效用 在制备色谱中，因为没有必要达到分析色谱那样的分离度，可以在一定范围内大大加大进样 的浓度和体积。在做分离的时候，也有一些分析色谱的时候，不能用到的技巧。因为篇幅关系， 不在这里叙述。 （13）柱转换技术 通过接头或者阀门，实现柱子的简单延长，或者比较方便地实现对其中一个（或几个）组分 的精制。 （14）比较新的制备色谱技术 模拟移动床可以连续进样，并可以利用边缘切割效用，而且采用了柱切换技术，能更好的利 用溶剂和填料，已经应用于工业化生产。其理论和技术也日益完善。 迎头色谱、超临界流体色谱、逆流色谱环形色谱、气相制备色谱等在科研和工业生产中也得 到了应用。 实验经验： 1 问: 我想购买waters600用于分析和制备，对于其配备有什么好的建议。 答：可以配一个PDA，另外加一个示差折光410，另外买几根制备柱就可以了。waters600的 流速最大为20mL/min，一般可以配20mm ID的制备柱，一次分离10-100mg的样品，如果样 品量更大，可以通过配件扩展到45mL/min，使用30mm ID的制备柱。另外为了保证馏分收集 的准确性，最好配上Fraction II 馏分收集器。 如果样品数量很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同时做自动进样并通过MS或 UV信号自动收集馏分。这样可以过夜自动运行。最大通量每天可以处理100-200个样品。 2 问： 如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？ 制备色谱柱为Zorbax SB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent 1100或 LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS 进行定性分析。如何设定色谱条件，如流量，进样量，样品的浓度，切割点的设置，是否要浓 缩，要求将95%以上的主峰切除。（主峰后有二个杂质靠得很近。） 答：制备用的流动相最好等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析；使用馏分收 集器时，延迟体积一定要计算精确，检测器的响应时间设到最小，否则都会影响收集的纯度和 回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm 制备柱用1*（9.4/4.6）2, 大约为4ml/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品 浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5ug，显然浓度太低，最好是 多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。 3 问： 我想用hplc分离一个简单的多肽,我应该选用什么样的流动相,还有他的梯度,还有选用 什么样的柱子 答： RP-HPLC,C18柱可以制备很少量的肽。如果用RP-HPLC，首先应该用同类型的分析柱 子分析一下多肽含多少杂质，设置缓缓的梯度的分离样品，在根据分析柱子跑出的峰形，逐渐 放大纯化的方法。 4 问：TFA在缓冲液中是不是只起到调节pH的作用呢？TFA的浓度越高基线的漂移越厉害， 那是不是说它的浓度在缓冲液pH允许的情况下越低越好呢？ 答：（1）TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1%，过高的浓度，会使溶液偏酸， 长时间使用可能影响柱子寿命。 （2）同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好 的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。 （3）走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。 5 问：样品如果溶解度太低如何上制备HPLC？ 答（1） 了解一下样品的性质,根据其酸碱性,极性等性质，通过调节溶剂的pH值等, 以达到较 好的溶解度 （2）样品可能某种晶型难溶，这样可以加入其他溶剂（如丙酮等）以助溶。 （3）不是一定要用流动相来溶解样品，对溶解度差的样品，可以选择甲醇，THF或DMSO等 溶解样品。特别是DMSO，对一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不会造 成干扰。而且DMSO的洗脱能力很弱，一般不会影响峰型。 （4） 可以固体上样。 6 问：多肽的分离制备, 如何上量？如何增大分离度? 答：反相HPLC应当是很好的分离小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流动相， 看保留如何，若无保留，建议改用其他色谱方法进行分离。 关于多肽的分离，首先要知道它的分子量大小，然后选择不同类型的填料，如孔径的大小。 我们先在分析柱（4.6MM内径）上做一下实验,找到最大的分离度,这一过程的难度是最大的, 要不断地改变流动相和固定相,然后再线性或非线性放大到制备,放大的倍数按分析柱的实验结 果。分离后可以通过冷冻干燥得到固体。 还可以考虑离子交换来分l离 ７问： 做柱层析时（国产大孔吸附树脂），怎么才能把洗脱液中的树脂残留物处理干净？ 答：大孔吸附树脂在上使用前，一般需要进行处理，方法包括用色谱纯的甲醇或乙睛洗到没有 吸收；或树脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常规的酸，碱洗。再用丙酮回流二小时 就可以用了。 8 问：由分析型液相转为制备型液相，其色谱系统需作多大调整？是否可以按照柱体积折算只 改变流速？其上样量多大为宜？ 答：（1）泵要换，流量要加大，压力可不变或减少；流通池要换体积更大的。 （2）整个系统的管路要更换更粗的，否则压力太大,而且特别容易发生堵塞。对流通池后的管 路，最好增加反压调节器，否则管路太短的话，反压小会导致流通池气泡，管路长的话会导致 峰展宽。 （3）检测器的响应时间和峰宽要设置合适，否则会导致收集时延迟体积的计算不准 (4)上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度、制备是否根据分析条件放大（例如制备柱是否 还用分析用填料）；一般上样量与柱子直径的平方以及长度成正比。 9 问：流动相中含有盐时，收集液该如何除盐？选用挥发性酸，碱或盐（如醋酸铵）是否会在 挥干溶剂或冻干过程中直接除去？ 答：一般可以采用离子吸附的办法去掉（可以参考离子吸附有关技术）。但也是稍微麻烦的事 情，最好，不加加酸碱盐，如果要加的话最好，要加挥发性的或者对产品或者检测没有干扰的。 可用G25脱盐，它是安马西亚出的一种葡聚糖凝胶。交联度大孔径小,对小分子的无机盐保 留较大,而对分子量较大的有机物没有保留从而可以将盐份脱除。另外采用挥发性的酸，碱时， 一般会在干燥过程中直接除去，但如果样品也有酸碱性，可能会与这些挥发性酸碱形成一定比 例的盐。 10 问：制备型柱子柱压上升 柱效下降 怎么办？ 答：对高价值的制备柱来讲，延长柱子寿命是很重要的。一般要注意保护柱子，一般来说，制 备柱子一般需要保护柱配套。 下面是可能堵塞柱子的原因 （1） 如果您所分离的样品中杂质较多而您在上样前没有经过过滤（0.45微米），一些颗粒性 杂质会积聚在柱头造成柱压升高， （2） 也有可能是因为您所使用的流动向中含有缓冲盐的原因，结晶或发生化学变化而堵塞。 可以把柱子冲一冲。 （3） 流动相是否符合液相色谱的要求？是否过滤处理？ 柱子再生处理办法如下： （1）依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5-10个柱体积。 （2）如果效果不明显，将柱子按以上顺序反冲，一般将大大降低柱子效果，不到不要没有办 法才采用。 （3）如果效果还是不好，就需要打开色谱柱，超声波清洗筛片（这样也会使柱子效果下降）。 必要时挖掉色谱柱内受污染部位，填入新的填料，还可用3个月。（填的时候小心，别重新污 染柱子） 11 问：制备柱柱跑干了影响柱效吗? 答：如果时间不长的话,可以用流动相多冲几个小时.柱效不一定变化很大.如果时间太久,柱效一 定变低. 具体造成影响有多大，要靠柱效测定来确定，而不是干柱时间的长短。如果跑干了， 对于PUMP的影响可能还大些，所以最好先把管路中的空气抽走再说。 一般说来，制备柱子跑干，属于操作失当。柱子闲置不用时，最好冲入甲醇或其他有机溶剂， 一定要把两头堵住密封，这样保留的时间会较长。 12 问：分析HPLC如何放大到制备型HPLC 答：在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小 于1:10000。进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积（小于1:100）。 在这种条件下，会达到 很好的分离效果，峰形尖锐并且很对称。 分析系统线形放大到制备型HPLC意味着使用直径更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱 的长度增加进样量并保持样品浓度不变。峰形仍会保持尖锐而对称。这种方法需要大型的色谱 柱和大量的溶剂来分离较少的样品，但这种方法从经济上一般不合适。 在制备液相中，最大的区别就是超量进样。制备的分离峰形一般不可能仍会保持尖锐而对称， 分析和制备是不同的概念。制备的首要概念是在达到纯化的基础上，降低成本，加快时间（提 高效率）。一般说来，纯化的成本要高于生产粗产品的成本，所以，可以加大上样量，甚至过 载，出现平头峰，而收集只集中在峰的一小部分，以来保证纯度，主要为了节省流动相和提高 设备利用率。 13 问：制备纯化蛋白、多肽，耗用流动相惊人，请问这些用过的流动相（乙腈，甲醇）可以 重蒸使用吗？ 答：流动相用一般减压方法重蒸后，往往会形成有机溶剂和水会共沸，另外，由于减压蒸馏属 于单次平衡，往往得不到100%纯度的溶剂，这会使溶剂的配置有一定困难，从而使色谱的重 现性和分离度会发生一定的变化。如果要求不是很高的话，一般可以分析重蒸后馏分中的各组 分含量，计算后再使用。 要通过重蒸得到纯物质是极其困难的，必须采用精馏塔多级蒸发，单就设备投资和能耗来讲， 实验室规模或生产规模的废液回收处理已经是得不偿失。其实，我们没有必要得到纯的物质。 14 问：反相色谱分离纯化后，怎样除去流动相产品中的TFA和乙腈或其他杂质？ 答： TFA是反相色谱分离中常用的添加剂。可以用冻干的办法去除，国外许多文献是这样报 道的。还可以试试离子交换、凝胶层析、甚至透析和超滤，其中，离子交换层析效果比较好， 还可以起到浓缩样品的作用。 首先，冻干的办法应该可以几乎彻底地除去TFA和乙腈，药物实验前最好先检测一下冻干品 中的残留量，只要不超过允许范围，这种办法是最最简单、有效的。 其次，如果你的药物的分装量不大的话(<100ug)，建议你用离子交换层析，最好装一个小一 点儿的柱子，让含盐洗脱峰的蛋白浓度达10mg/ml以上，稀释后完全符合试验要求。如果用分 子筛，考虑稀释，最好也先过一个离子交换。此外可以试试疏水层析。如果产品是碱的话，可 能会形成TFA盐，这样通过上述方法就无法除去。一般可以用碱水洗，然后将产品萃取出来。 或者在里面加入一定量的盐酸，再干燥后形成盐酸盐。 15 问：同一种填料的分析柱、制备柱按线形放大公式套，分离度会不会变化？ 答：一般会有一定的变化，原因有以下几点 （1） 制备柱的装填是否均匀，如不均匀则可能产生涡流扩散使各个组分的经过通道的直径不 同、阻力不一样，停留时间不同，色谱峰可能变宽。 （2） 如果样品在流动相中溶解度小，在制备色谱上会有不同的峰展宽。 （3）如果样品在分析柱上有展宽或拖尾的现象，放大到制备柱上后峰的展宽和拖尾经常会非 常严重，导致分离失败。 16 问：制备色谱柱如何测柱效？ 答：可以选择几种物质，苯，甲苯，萘、蒽等的衍生物上柱，流动相一般用65-80%的甲醇/水， 测定后根据保留时间计算塔板数。由于制备色谱的管路死体积一般比较大，很难得到和供应商 相同的柱效。建议在制备柱开始使用时在自己的色谱上测一下柱效，然后定期检测柱效进行以 进行比较。 17 问：反相色谱分离后，如何快速从流动相中得到产品？ 答：可以考虑先在低温下，减压旋蒸除去其中的有机溶剂，然后用萃取的方法（如乙醚、氯仿 萃取等）把产品萃取出来，然后再低温再旋蒸，这样，就可以不将温度升得很高而得到产品。 如果要直接蒸掉流动相，水泵的真空度要注意（要检查气密性），否则蒸水会很慢。一般比 较好的泵在60-70度即可蒸掉水，如果泵的真空度不好，可能需要80-90度才行，这样容易暴 沸导致样品损失。另为，温度太高可能引起物质变性。 |
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