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正交试验法在微生物培养条件优化选择中的应用
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一．目的要求 对于一个生物作用过程，其结果或产物的得到受到多种因素的影响。如发酵中，菌种的生物活性、酶的浓度、底物浓度、温度、pH 值、菌种生长环境中的氧气、二氧化碳浓度、各种营养成分的比例等。对于这种多因素的实验，如何合理地设计实验，提高效率，以达到所预期的目的是需要进行认真考虑和周密准备的。 本实验运用正交实验法测定酵母用量、葡萄糖浓度、温度、磷酸盐用量这四个因素在不同水平对发酵过程和结果的影响，并应用生物统计学的计算方法分析处理实验数据，求得什么样的酵母用量、葡萄糖浓度、温度、磷酸盐用量对发酵效果最好，并确定影响实验的关键因素及最适条件。 二．基本原理 正交实验法是安排多因素、多水平的一种实验方法，即借助正交表的表格来计划安排实验，并正确地分析结果，找到实验的最佳条件，分清因素和水平的主次，这就能通过比较少的实验次数达到好的实验效果。实践证明，正交法是一种行之有效的好方法，被广泛地运用于工农业生产和科学研究实验。 ’ 三．正交实验法的基本步骤 1）．明确试验目的，确定评价指标 评价指标有时只有一个，有时可能有多个。当评价指标多于两个，为多指标试验。 2）．挑选因素 影响试验指标的因素很多，由于试验条件的限制，不可能逐一或全面地加以研究，因此要根据已有的专业知识及有关文献资料和实际情况，固定一些因素于最佳水平，排除一些次要的因素，而挑选一些主要因素。正交试验设计法正是安排多因素试验的有利工具。当因素较多时，除非事先根据专业知识或经验等，能肯定某因素作用很小而不选取外，对于凡是可能起作用或情况不明或看法不一的因素，都应当选入进行考察。 3）．确定各因素的水平 因素的水平分为定性与定量两种，水平的确定包含两个含义，即水平个数的确定和各个水平数量的确定。 对定性因素，要根据试验具体内容，赋予该因素每个水平以具体含义。定量因素的量大多是连续变化的，这就要求试验者根据相关知识或经验、或者文献资料首先确定该因素的数量变化范围，而后根据试验的目的及性质，并结合正交表的选用来确定因素的水平数和各水平的取值。每个因素的水平数可以相等，也可以不等，重要因素或特别希望详细了解的因素，其水平可多一些，其他因素的水平可以少一些。如果没有特别重要的因素需要详细考察的话，要尽可能使因素的水平数相等，以便减小试验数据处理工作量。 4）．制定因素水平表 根据上面选取的因素及因素的水平的取值，制定一张反映试验所要考察研究的因素及各因素的水平的“因素水平综合表’’。该表在制定过程中，对于每个因素用哪个水平号码，对应于哪个量可以随机地任意确定。一般讲最好是打乱次序安排，但一经选定之后，试验过程中就不能再变了。 5）．选择合适的正交表 常用的正交表较多，有几十个，可以灵活选择。应注意的是，选择正交表与选择因素及其水平是相互影响的，必须综合考虑，而不能将任何一个问题孤立出来。选择正交表时一般需考虑以下两个方面的情况： ①所考察因素及其水平的多少。选用的正交表，要能容纳所研究的因素数和因素的水平数，在这一前提下，应选择试验次数最小的正交表。 ②考虑各因素之间的交互作用。一般说来，两因素的交互作用通常都有可能存在，而三因素的交互作用在通常情况下可以忽略不计。 6）．确定试验方案 根据制定的因素水平表和选定的正交表来安排试验时，一般原则如下： ①如果各因素之间无交互作用，按照因素水平表中固定下来的因素次序，顺序地放到正交表的纵列上，每一列放一种因素。 ②如果不能排除因素之间的交互作用，则应避免将因素的主效应安排在正交表的交互效应列内，以妨碍对因素主效应的判断。 ③把各因素的水平按照因素水平表中所确定的关系，对号入座后，试验方案随即确定。 7）．正交试验结果的分析 正交试验结果的直观分析与正交试验结果的方差分析相比，具有计算量小、计算简单、分析速度快、一目了然等特点，但分析结果的精确性与严密性相对于方差分析来说稍差。直观分析主要可以解决以下两个问题： ①求最佳水平组合。该问题归结为找到各因素分别取何水平时，所得到的试验结果会最好。 极差的大小直接反映料各个因素对试验指标影响的变化幅度，极差大表明该因素的影响越大，是主要因素；反之，极差小，表明该因素的作用不大，属于次级因素。因此，可以通过比较各个因素的极差大小决定因素的主次顺序。但因素影响的显著性需通过方差分析确定。 四．实验装置 图10－1 为5L 容积的发酵罐培养装置示意图。发酵罐为不锈钢制的圆柱形，外有夹套以便加热或冷却。搅拌可采用电机带动或磁力搅拌器。空气过滤可采用介质层过滤或聚乙烯醇PVA 滤芯空气过滤气。采用可蒸汽杀菌的pH复合电极及pH控制装置，溶解氧分析仪使用的是可反复蒸汽灭菌、原电极型覆膜电极。 采用2 台泵，一台用于流加酸碱，一台用于流加消泡剂。所使用的辅料管应是可蒸汽灭菌，使用的管材有长期耐用的硅胶管(一般用)、氟化橡胶管(碳氢化合物用)和耐酸、碱用管等。 采用氧分析仪测定尾气中的氧分压，用红外分析仪测定尾气中二氧化碳分压。 五．实验方法 1) ．菌种： 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。 2）．培养基制备 培养基的加入量一般为罐容积的70％。将称量好的培养基组分，经溶解后加入到发酵罐中。此时培养液的体积为实际所需培养基容积的80％。 由于蒸汽杀菌过程中有大量的蒸汽转变为水，使发酵液体积增大。对于合成培养基的灭菌操作，葡萄糖与磷酸盐应分别灭菌后，在开始培养前加入以避免在杀菌过程中，葡萄糖与氮化合物之间发生美拉德(Malad)反应，以及磷盐与其他金属离子形成沉淀。溶液pH5．0. 除排气口加棉塞，并包牛皮纸或铝箔外，其他可用橡胶塞或截水夹封住。 3)．安装控制装置 连接好各种传感器的管线及通风、水管等,安装调试好pH 电极、温度计、氧电极、消泡电极等。 4)．杀菌 夹套内通入加热蒸汽，使培养液温度达到80℃以上。随后将蒸汽直接通人发酵罐，在121℃下杀菌15min。杀菌过程中，间断打开各阀门，排出内部空气，以保证各出管内杀菌完全。杀菌完成后，夹套内通入冷却水，进行培养基的冷却。为保证罐内正压，应通入适量无菌空气。 5)．接菌、培养 检查温度、通风和pH 等条件正常后接菌，将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火后打开接种口，加入无菌水，调节好罐内培养液量,进而将种子培养液注入。接种量一般为1%～10％，盖好接种口后，调节搅拌转速至所需数值，培养开始。为了解培养过程中的变化，需定时取样进行样品分析。取样后应通入加热蒸汽，以防取样管路污染杂菌。 6)．制定因素水平表和选定正交表进行正交试验 7）．培养结束 将电极与培养液全部取出，培养液在121℃下杀菌15min 后，排放到指定地点。罐内应冲洗干净。 8) 菌体量(X)分析方法 用去离子水适当稀释培养液，在660nm 下测浊度。测干燥重量时，用事先干燥至恒重的定量滤纸(孔径1．2pm)过滤培养液，用去离子水洗两次，然后将其干燥至恒重(105℃，10h)，用电子天平称重。 9) 数据处理 画出培养液中葡萄糖(g／L)、酵母菌体量(g／L)随培养时间的变化曲线。计算酵母产率(质量分数，葡萄糖)。 |
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