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[交流]
ＷＥＳＴＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ心得
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做了五个月的ＷＢ，有一点点小心得，给新手点经验． 蛋白提取： １． 总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）： 组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清. Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加) 7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存 ２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行 （1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次30秒,重复3-5次. （2）离心机 1000rpm，4℃ 离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织及结缔组织) （3）100000g，4℃ 离心 1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可 )。沉淀用适量的 Buffer B重悬，4度过夜后，分装至 EP管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4℃ 离心 30min。 （4）收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A： 0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。 如果要定量的话，最好能立即根据浓度，加入上样缓冲，煮沸，4度保存。反复冻融蛋白会降解，浓度不准。 考马斯亮兰Ｇ２５０测蛋白浓度： 考马斯亮兰Ｇ２５０配方：G250 0.4克, 95%乙醇100ml, 85% 磷酸 200ml, 加水至2000ml,过滤后使用。 BSA标准液：0.5mg/ml BSA, 双蒸水配制。 配制标准液(浓度分别为0，10，20，30，40，50ug/ul)： 1 2 3 4 53 6 G250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 0.5mg/ml BSA ------ 20ul 40ul 60ul 80ul 100ul ddH2O 100ul 80ul 60ul 40ul 20ul ----- 待测蛋白配液：每管3ml G250，2ul样品，98ul ddH2O。（若加入样品后，液体没有变蓝色，则可再加2ul样品，ddH2O减为96 ul，标准液浓度可适当扩大。） 紫外分光光度计，595nm，用1号管调零，制出标准曲线, 标准方程及R值（R值应大于0.99, 否则操作误差较大）,测量待测蛋白OD值，算出蛋白浓度。（若加入2ul样品，则浓度值需除2，方为真正浓度； 若加4ul样品，则除4） 聚丙烯酰胺电泳： 1．自来水，洗涤剂清洗玻璃板，用ddH2O冲洗干净，立放于盒子内，60度烤箱烘干备用。 2．配胶： 凝胶储备液（30% Acr/Bise）： 丙烯酰胺29克，双体甲叉双丙烯酰胺1克，加水至100ml。（有说要棕色瓶保存，3个月换新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉） 10%APS：0.1克过硫酸铵，加 ddH2O至1 ml.(4度保存,一周内使用)，本人都是配新鲜的用。 10%SDS: 1克SDS,10 ml ddH2O. (不溶时,可加热50度左右助溶.) TEMED: 原液即可. 0.5M Tris-HCl (PH6.8)； 1.5M Tris-HCl (PH8.8): 9.0855克Tris, 加入ddH2O溶解后,用HCL调PH至8.8,加ddH2O到50ML 配胶的浓度和方法书上都有，不详细说了！ 本人做的是70KD 和17KD 的分子量，分别配了10%和12%的分离胶，4%的浓缩胶。摇动溶液充分混合（不要过于剧烈以免引入过多地氧气）灌入2/3的分离胶后（估计距梳子底1CM）应立即用ddH2O封胶。等到能看清水和胶的分界线，则可配浓缩胶。用面巾纸吸干水后，注入浓缩胶，至顶。插入梳子，不要有气泡。 蓝色字体是从别人贴子上看到的 这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000） PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用。 胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS），封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。 等浓缩胶凝的时间，就可以配蛋白了。按照想要的浓度加入LOADING BUFFER配制。本人按每孔总体积20ul, 终浓度1* RSB，含50ug蛋白混合样品，不足的体积用1* PBS补足。短暂离心后，沸水中煮5分钟，放室温，用时再短暂离心。 例如. 50ug/20ul，做2.5孔, 即50ul，125ug 1 2 3 4 蛋白浓度 10．33 ug/ ul 13．91 ug/ ul 14．87 ug/ ul 19．03 ug/ ul 所需体积 12.1 ul 9 ul 8.4 ul 6.6 ul 5*RSB 10 ul 10 ul 10 ul 10 ul 1* PBS 27.9 ul 31 ul 31.6 ul 33.4 ul 5*RSB: 1.89克 Tris-HCL(PH 6.8), 5克 SDS, 0.125克溴酚蓝, 25ML 甘油.(很粘稠) Beta-巯基乙醇用时现加,按25%比例. 10* PBS: Nacl 4.25克,Na2HPO4. 12H2O 15.4g, NaH2PO4 2H2O 1.4g, 调PH到7.2-7.4,加ddH2O到500ML 约30分钟左右, 取下梳子,将胶板放入电泳槽内,加入1*电泳缓冲液, 冲洗加样孔. 微量进样器逐个加样,空泳道加入1* RSB. 两胶板之间的电泳液要满. 接好正负极, 开始电泳, 可先小电压,约50V ,大约跑过浓缩胶后再改为100V. 观察MARKER的情况, 适时终止电泳. 建议说目的带要跑到分离胶的2/3处比较好,但本人一直都在上1/3处,结果也还可以. 预染MARKER很重要,开始选了一个国产的,总是跑不好,后来换成NEB的,效果很好,而且也不贵,范围也比较广,把我要的7.,42.17全都包括在内. 如果浓缩胶跑的好的话, 几个孔的蛋白会跑成一条直线. 注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内. 10* 电泳缓冲液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML. 不好溶,可用搅拌器. 可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不麻烦. 转膜 跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何. 另一块可用做转膜. 放入转移缓冲液中摇30分钟左右（有次着急只晃了10分钟，结果也挺好的）。开始用的PVDF膜, 0.45um, 用国产的MARKER后,总是染的不清楚, 而且无论时间长短, 最后一块滤纸都会被染色. 后来换了NEB后,PVDF也不容易上色(可能和PVDF的质量有关,我买的虽然也是MILLIPORE,但好像比较便宜20CM*10CM才50块钱). 丽春红染色也很少能看清条带,后来发现,染色后用甲醇洗,比较容易看出来,但是很难洗掉红色，不知道有没有影响。后来换成NC膜，0.22um ，效果挺好的，MARKER易染上，丽春红也易着色，还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。 不同转膜仪和电源转膜的条件不同，我用的是BIO-RAD 的半干转（电压不过25V的那款），电源是BIO-RAD的PC200，70KD的我转50分钟，20V，17KD的转20V，30分钟左右，条件不是很稳定，有时半路打开盖子看看MARKER转的情况，但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流，说1.2-2MA/CM2我看了一下，我的胶大约都是5*3左右大的，20V一般电流会是60-30MA之间，要是这样算的话,最高就30MA, 我不太清楚. 如果用PVDF膜，先用甲醇浸泡一段时间，我一般是5分钟，但也有人说不过30秒，不清楚。换了NC膜就直接放入转移缓冲液中的，晃30分钟左右。 滤纸开始是买的那种专用滤纸，上面三张，下面三张，后来有人说这种滤纸是做湿转用的，应当用那种比较厚的，上下各一张，我也不知道，后来就换成普通滤纸了，上下大约各15张左右，有时着急还反复用过，效果也还可以，估计问题不大。 因为这款半干转膜仪说明书上说不会短路，所以一般滤纸》膜》胶. 他们之间一定不要有气泡.。膜上要做好标记，识别正反面和上下,切个小角是常用的方法, 有MARKER也方便记. 转膜后的胶可用考染看看转膜情况. 考马斯亮蓝R250: R250 0.25克, 甲醇50ML, 冰乙酸40ML, 加水到100ML. 脱色液: 乙酸 50ML, 甲醇225ML(可用乙醇), ddH2O500ML 10*丽春红(20ML): 2%丽春红(0.4克), 30%三氯乙酸(6克), 30%磺基水杨酸(6克). 用时加入9 倍的ddH2O 10*转膜缓冲液: 70KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, SDS 1.85克, 加水到500ML. 用时取10ML, 加20ML 甲醇, 加70ML 双蒸水 17KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, 加水到500ML. 用时取10ML, 加50ML 甲醇, 加40ML 双蒸水 封闭 用5%的封闭液(伊利的高钙脱脂), 室温,摇床1小时. 5%封闭液: 1克脱脂奶粉, 20ML洗膜液. 洗膜液: 10*PBS 50ML, 450ML ddH2O, 0.5ML TWEEN-20 抗体孵育 将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可) 一抗:用杂交液配置.浓度可根据点蛋白实验,及ECL要求来定. 4度,过夜.最好有那种4度摇床.我一般早上到实验室后,再摇床上再摇3个小时左右. 洗膜液洗3次,每次10分钟. 二抗: 用杂交液配置.室温,摇床,1小时. 洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟. 如果一抗没有混浊,放置时间不长,可以重复使用,本人一般连作二天时,才会重复用,如果因为一抗的原因而不出结果,太不值了. 杂交液: BSA0.5克, 洗膜液50ML.4度保存,如有混浊,重配. 点蛋白试验: 在正式作WESTERN之前可先做这个,如果没有结果可能提蛋白中不含目的蛋白,也可能一抗与目的蛋白结合不好,或一,二抗结合不好.(之前拿一滴二抗和ECL试一下是否发光,以排除二抗的问题).若有结果,可能选择一个比较合适的一,二抗浓度. 取小块膜,放到24孔板中(PVDF先有甲醇泡,烘干),滴上不同浓度的蛋白(先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干),加封闭液,室温,摇床一小时, 洗去. 加不同浓度一抗,2-3小时, 室温,摇床.洗膜液洗3次,每次10分钟.不同浓度二抗一小时, 室温,摇床. 洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.显色 ECL显影 将膜上多余的水吸干,与胶相邻的一面向上,按ECL说明书配置发光液.点在膜上. 不同厂家ECL要求不一样,本人用的ECL二种液体1:1混合后,0.125/CM2, 放置2分钟,吸干(可以用微量加样器抽回来,可连续用下一张膜),放在保鲜膜上,包好,压片. 若肉眼可见发光,可压10-20秒; 若看不到,可压30分钟.(再长的时间没试过,一般30分钟不出,就重新再回一次ECL,重做一次,若再不出,就认为没有了.) 转完膜后的膜如果不能及时做,可放在洗膜液中,4度保存,最多放过2天,时间长了就不知道了. |
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