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[资源] 重组PCR-etc

PCR自测题
一、名词解释
1、PCR: 即聚合酶链式反应。在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。
2、变性：于PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
3、退火： PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。
4、延伸：当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5‘→3’延伸反应，形成新生DNA链。
5、逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行的PCR反应。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、共享引物PCR：利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。
8、多重PCR：在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。
9、反向PCR：利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3‘端和5’端引物扩增未知序列。
10、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。
11、LCR：连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5‘磷酸与另一相邻链的3’羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。

1、简述PCR反应的基本步骤。
   PCR反应的基本步骤包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。
（1）变性（denaturation）：加热使双链DNA变为单链;
（2）退火（annealing）：当温度降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区结合，形成杂交链，这一过程称退火。当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA的分子数大大超过模板DNA的分子数，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；
（3）延伸（extension）：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应。

2、简述PCR模板的种类及制备方法。
DNA和RNA均可作为PCR的模板。
DNA可以直接作模板加入反应体系进行扩增，RNA的扩增需要逆转录为cDNA后才能进行PCR扩增，故又称这种扩增方式为RT-PCR。DNA模板的制备通常采用去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸或水煮沸溶解细胞。
RNA模板的制备可采用RNA提取试剂盒、酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法、异硫胍氯化铯密度梯度分离法、SDS-酚-氯仿法。制备RNA模板时，要注意防止RNA水解。

3、简述PCR产物的积累规律。

PCR产物的积累规律：PCR反应过程遵循酶促动力学规律。在反应初期，反应产物以指数方式累积。随着反应的进行，体系中的各成分的比例发生变化，扩增速度逐渐放慢。反应后期，酶的催化反应趋于饱和，反应曲线出现拐点而进入反应的“平台期”。
达到平台期所需的PCR循环次数取决于反应体系中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性、引物质量、以及非特异性扩增条带的竞争等诸多因素。

4、简述PCR的基本反应。
（1）以DNA为模板的反应：反应体系一般选用50～100μl体积；其中含有缓冲液、MgCl、明胶或牛血清白蛋白、引物、4种dNTP、模板DNA、TaqDNA聚合酶。封上矿物油防止高温反应时液体的挥发，即可进行PCR反应。
（2）以mRNA为模板的反应：以mRNA为原始模板进行的PCR反应称为逆转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)。首先将mRNA逆转录生成cDNA，然后再进行PCR反应。逆转录反应体系一般选用20μl体积，其中含有RNA酶抑制剂、缓冲液、４种dNTP、MgCl2、DTT、牛血清白蛋白、oligo(dT)12-18引物，RNA模板、逆转录酶。逆转录反应在42℃进行，随后将反应混合物加热在95℃，5分钟，灭活逆转录酶。取2μl反应产物，按DNA为模板的PCR反应步骤、进行扩增反应。

5、简述PCR实验应注意的事项。
由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品污染便有可能导致假阳性结果的出现。为此在实验操作中应谨防污染的发生，并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。在有条件的情况下，PCR实验室应设.样品制备区、PCR操作区及反应产物分析区；在进行PCR反应时，应设阳性对照、阴性对照和试剂对照；扩增反应总是阴性结果（无产物）时应采取的措施：⑴取10µl扩增混合液作模板再进行PCR扩增；⑵增加TaqDNA聚合酶的浓度；⑶增加靶DNA的量；⑷若模板为粗制品，提纯样品；⑸增加扩增循环次数；⑹适当降低退火温度；出现非特异性产物时应采取的措施：⑴增加退火温度；⑵减少TaqDNA聚合酶的浓度；⑶减少退火及延伸时间；⑷减少引物浓度；⑸减少扩增循环次数。

6、简述连接酶链反应的基本原理。
LCR的基本原理是设计两对引物，分别与模板双链DNA分子的一条链互补。然后用连接酶将两邻接的引物连接起来，如果模板链没有碱基突变，那么引物就可以与模板完全互补，两引物就通过磷酸二酯键连接成为下轮扩增的模板，如果模板链上有突变，在两个引物的连接处有一个或多个碱基不能配，那么两条引物就不被连接。因此没有连接产物就表明靶分子上至少有一个不配对碱基对。

7、简述RNA体外扩增的特点。
RNA体外扩增特点：（1）反应中不需对核酸进行变性与复性；（2）其原理与PCR相似，反应分非循环相与循环相；（3）依赖于逆转录酶，RNase H和T7RNA聚合酶的共同作用；（4）反应体系中含两种特异性引物，分别用A，B表示，其中引物A含T7RNA聚合酶识别的启动子，它与待测RNA的3′端序列互补，引导合成cDNA的第一链。引物B与cDNA第一链的3′端序列互补，如果打算扩增全长的RNA，则引物B的序列与原始RNA的5′端序列一致。5.反应体系中含有dNTP和NTP两种类型的核苷酸，dNTP用于合成cDNA，NTP用于合成RNA。

六、论述题
1、试述PCR的基本原理及引物设计原则。
PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。
PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。引物设计一般遵循下列原则：
（1）引物长度一般为15~30个核苷酸。（2）碱基随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。G+C的含量为45~55%。3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C。（3）避免发夹结构形成，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。（5）引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。（6）引物3′端碱基一定要与模板DNA配对，最佳碱基选G和C。（7）引物的5′端可以修饰，如加限制酶位点，引入突变位点，起始密码子，终止密码子等。

2、试述PCR技术的特点。
(1）操作简便：完全自动化的操作，在循环期间，无须专人守侯，非常方便。
（2）省时：一个PCR反应周期，包括94℃～95℃变性30～60秒﹑50℃～65℃退火30～50秒﹑70℃～75℃延伸50～90秒；再加上预变性5～10分钟﹑最后一次循环后在70℃～75℃继续延伸10分钟，假设n=30个循环完成后，一般只需要2～2.5小时，就可完成扩增反应。
（3）灵敏度高：从理论上讲，一根头发，一个精细胞，一个二倍体细胞内的DNA都可得到扩增。单个细胞的PCR技术现已广泛地被采用。一般，PCR反应中模板的加入量约为102拷贝的靶序列,就可以进行PCR 反应。
（4）特异性强：特异性是指PCR发生错误引发的频率，特异性还反映了导致无关扩增产物的错配发生的频率。PCR反应只是在一对引物之间引发，因此，对反应液进行核酸电泳时，只能得到一条清晰的确定大小的条带。
（5）模板材料易获得：许多标本均能用于PCR反应，如细菌和病毒标本﹑血液或细胞标本、化石﹑鼻﹑咽﹑口腔及生殖器的拭子标本等。固定和包埋的石蜡或冰冻组织标本，拷贝数低﹑DNA已有损伤或降解的古化石标本均能进行PCR扩增反应。一般用于PCR反应的样品必须经过适当的处理，其目的有①去除能抑制Tag DNA聚合酶活性的杂质, ②使待扩增的DNA暴露，能与引物相结合。只要达到该要求即可，对纯度要求并不苛刻。
（6）有一程度的单核苷酸错误掺入：TagDNA聚合酶无3′→5′外切活性，对错误掺入的单核苷酸无校正修复功能，故PCR反应产物会有一定程度的碱基错误掺入。使用不同的DNA 聚合酶，其错掺率也不相同。碱基错掺率的大小决定着PCR对模板序列忠实性的高低。在一个非常精确PCR反应体系中，硷基错配是可以忽略不计的。但是在进行PCR-Cloning 实验时，必须考虑由此带来的影响，是否会引起阅读框架的漂移或改变。
（7）PCR 扩增终产物3’端-OH的加尾：分析PCR产物两单链3’端的碱基，发现总带有一非模板依赖性的碱基，而这种多出来的“毛边”碱基几乎总是A。可能由于Tag DNA聚合酶有末端转移酶活性，在扩增产物的3’端随机加上一种单核苷酸，而对A的加入具有优势。利用这一特性，人们构建了一类新型的分子克隆载体—即3’端dT或ddT加尾载体，统称T载体，它可与末端携带dA的PCR产物进行连接，简化克隆步骤。
（8）PCR产物的积累规律：PCR反应过程遵循酶促动力学规律。在反应初期，反应产物以指数方式累积。随着反应的进行，体系中的各成分的比例发生变化，扩增速度逐渐放慢。反应后期，酶的催化反应趋于饱和，反应曲线出现拐点而进入反应的“平台期”。

3. 试述PCR反应条件的优化：
（1）引物：引物设计及合成质量的好坏至关重要，合成的引物常用聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向层析柱进行纯化。冻干的引物可于-20℃下保存1～2年，液体的引物在-20℃下保存6个月。在一个标准的PCR反应中，引物的终浓度为0.2～1mol/L。
（2）缓冲液：目前常用的PCR缓冲体系为pH 8.3～8.8（20℃）的10～50 mmol/L Tris-HCI。pH变化于6.8～7.8之间。改变Tris浓度，有时会增加产率。
（3）Mg2+： Mg2+离子浓度影响Taq DNA聚合酶的活性和忠实性，还影响引物的退火﹑模板与PCR产物的解链温度﹑产物的特异性﹑引物二聚体的形成等。
（4）dNTP：TaqDNA聚合酶缺乏3→5端的外切活性，没有校错功能，会产生碱基的错误掺入。所用的四种dNTP的终浓度应该相等，以使错掺率降到最低。
（5）耐热DNA聚合酶：耐热Taq DNA聚合酶的引入是PCR实验成败及走向实用化的关键。除了耐热Taq DNA聚合酶外，还开发了其它耐热酶，如Pfu、Vent 和Tth 等，并且还用基因工程的方法生产了一些重组的耐热酶。
（6）温度循环参数：
退火温度退火温度的优化首先采用计算引物-模板对的Tm 值。但其中一个单一碱基的错配大约降低Tm 值5℃。所以应将Tm 值看为估计值。
变性温度典型的变性条件是95℃ 30秒，或97℃ 15秒。对于富含G+C的靶序列，温度高可能更有效，但是也会影响酶活性。最好采用薄壁的试管。
延伸温度作为一般的规律，Tag DNA 聚合酶1分钟延伸1kb的长度。在通常选定的延伸温度下（70～72℃），Tag DNA 聚合酶将以每分钟3.5kb的速率延伸
（7）循环数：循环数决定着扩增程度，在其它参数都已优化的条件下，最适循环数取决于模板的初始浓度。在初始靶序列浓度为3×105  ﹑5×104 ﹑1×103 ﹑50个拷贝分子时,其循环数可分别为25～30﹑30～35﹑35～40﹑40～45 个循环。
（8）PCR促进剂：二甲基亚砜（DMSO）有变性DNA模板的作用，对Klenow 片段有利，但对Tag DNA 聚合酶有抑制作用，尽量不用。甘油有助于PCR反应的复性过程，尤对G+C含量高和二级结构多的模板以及扩增长片段（>1500kb）更适用，但并非对所有的PCR均有益。氯化四甲基胺（TMAC）可以去除非特异性扩增，促进PCR但又不抑制Tag DNA 聚合酶。

4、试述PCR的主要类型及其工作原理。
（1）筑巢PCR  筑巢PCR法是用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因。筑巢法PCR反应中，由于模板必须与4个核苷酸引物结合才能获得阳性结果，因此特异性很高。
（2）共享引物PCR  利用3条引物来扩增两种不同的DNA序列。其中一条引物与两种DNA序列都互补，这条引物与另外两条引物分别组成两对PCR引物。
（3）多重PCR  即在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。
（4）不对称PCR  其原理是采用不同的引物浓度，经PCR扩增得到单链DNA。一般采用50～100：1比例的引物浓度，其中低浓度引物通常为0.5~1.0pmol/L。在PCR前25个循环中，主要生成双链DNA产物。在低浓度引物逐渐耗尽时，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA，分离此扩增产物中单链DNA，利用原引物或扩增单链DNA序列内的另一条引物直接测序。
(5)锚定PCR（anchored PCR）通常采用的PCR反应必须知道欲扩增DNA或RNA片段的两侧的序列，锚定PCR可以帮助克服序列未知或序列不全知所带来的障碍。其主要原理分离细胞总RNA或mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA 3′末端加上poly(dG)尾。设计一条与此poly(dG)相对应的锚定引物poly(dC)。在锚定引物和与基因特异配对的另一条引物参与下，可以扩增此带同源多聚物尾巴的DNA序列。
(6)反向PCR（inverted PCR）反向PCR可以扩增已知DNA序列两侧的未知序列，亦可用于未知DNA片段的测定。其主要方法是用一种或几种限制酶将基因组DNA完全消化，但已知序列内部不应有这些限制酶切割位点，经消化后的大大小小的DNA片段中就会有我们所需要的片段，用连接酶将这些片段连接成环状。用单一限制酶原点切割已知序列。根据已知序列的碱基顺序设计3′端引物和5′端引物扩增未知序列。当然也可直接以环状的DNA为模板，扩增未知序列。
(7)彩色PCR（ color complementation assay）  又可直译为“着色互补性检测”或称荧光PCR 。荧光PCR的原理就是用不同的荧光染料，如红色的罗丹明（POX）和绿色的荧光素FAM等分别标记PCR引物的5′端，进行PCR扩增后的产物就会有不同色彩的染料，可发出不同颜色的荧光。用荧光激发灯观察电泳结果，可见到彩色产物，并可彩色照相。
彩色PCR可用于基因诊断，也可用于几种可疑病毒感染的诊断。
(8)原位PCR（in situ PCR）将原位杂交的细胞定位技术和PCR的高灵敏度相结合，产生了原位PCR技术。其原理是以组织固定处理细胞内的核酸或RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程。与其它PCR方法不同的是，原位PCR不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。用探针与PCR扩增产物原位杂交或与PCR标记引物的显色技术结合，原位PCR成为检测靶基因的细胞定位，组织分布及靶基因表达的重要手段。应用于肿瘤发生学，胚胎学，RNA转运和病毒学检测等。
(9)定量PCR（quantified PCR）其原理是以mRNA为模板合成cDNA后，再在同一反应管内同时加入参照基因和待测基因，参照引物和待测基因引物进行PCR扩增，以参照基因的扩增产物为基础，观测待测基因产物的相对量。内参照采用报告基因的RNA，如β肌动蛋白，3-磷酸甘油醛脱氢酶，rRNA基因等。设内参照的目的是消除反应中存在的各种因素对PCR反应结果的影响，同时去除采用不同反应管所发生的试管效应。常用于mRNA定量。
(10)差异显示PCR（differential display PCR）差异显示PCR又称差异显示逆转录PCR（DDRT-PCR）。是一种筛选和克隆受发育，突变、各种因素影响下差异表达基因的方法。其原理是将两种mRNA的样品逆转录成cDNA的第一链。然后加入两种引物进行PCR反应,一种为锚定引物，另一种为10聚体的随机引物。锚定引物12种，随机引物24～26种，按随机组合共有288个PCR反应，那么两种mRNA就有576个RT-PCR反应，这样能将哺乳动物细胞内任何一种cDNA中的一个片段扩增出来。PCR产物作为相应mRNA的代表，采用变性或不变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相互比较，可以发现两种样品PCR产物的差异片段。再将这些差异片段进行扩增，与mRNA进行杂交分析，同时进行克隆和序列分析，最后确定差异表达的基因。
(11)重组PCR（recombinant PCR ）重组PCR说得简单一些就是PCR参与的体外基因突变过程或基因融合过程。
基因突变：即在基因需要突变的位点，按照位点的前后核苷酸序列设计一个与目的基因靶序列互补，但改变了其中一个或几个核苷酸的引物，用该引物进行PCR，扩增的目的基因上都带有改换过的核苷酸，即是说目的基因靶序列处的核苷酸改换了。
基因融合：即在两个PCR扩增体系中，两对引物中分别由其中之一在其5′末端和3′末端引物带上一段互补的序列。混合两种PCR扩增产物，经变性和复性，两种PCR产物通过互补序列发生粘连，其中1条重组杂合链能在PCR条件下发生延伸反应，产生1个包含两个不同基因的杂合基因，即融合基因

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