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panda73

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切 已有3人参与

大家都说，在进行分子克隆实验时，载体的处理很重要，一定要将载体酶切完全，才能减少载体自连，降低连接时的本底，提高克隆成功率。一般NEB和Takar都会推荐双酶切的buffer，但大家有精确计算应该使用的酶量的方法吗？请推荐
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1楼 2011-12-10 23:00:43
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豆豆鱼

木虫 (正式写手)
★ ★
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西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-12-12 18:24:23
按照说明书上的酶切体系，选择酶切浓度很重要，但不一定很准确，需要你自己进一步验证才符合实际情况，毕竟关于载体的浓度是你自己提取的，还有一些其他因素需要考虑，祝顺利。
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2楼2011-12-12 08:17:36
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wanyifei0123

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 同意！ 2011-12-12 18:24:35
一般要对待切的载体做定量，琼脂糖凝胶初略定量就够了不用太精确，然后计算一下酶用量（1U差不多60min消化1ugDNA）。酶说明书上的用量一般没有问题，但是生产商用的底物和我们常常是不同的，所以最好适当调整——主要是要避免酶中的甘油在体系中的比例太大影响酶切效果。
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3楼2011-12-12 08:20:26
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guojianping

木虫 (正式写手)
★
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一般来说NEB的1微升切2小时肯定是够了的，没什么需要算的精确的
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4楼2011-12-12 19:33:26
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