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panda73

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切 已有3人参与

大家都说,在进行分子克隆实验时,载体的处理很重要,一定要将载体酶切完全,才能减少载体自连,降低连接时的本底,提高克隆成功率。一般NEB和Takar都会推荐双酶切的buffer,但大家有精确计算应该使用的酶量的方法吗?请推荐
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豆豆鱼

木虫 (正式写手)

★ ★
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西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-12-12 18:24:23
按照说明书上的酶切体系,选择酶切浓度很重要,但不一定很准确,需要你自己进一步验证才符合实际情况,毕竟关于载体的浓度是你自己提取的,还有一些其他因素需要考虑,祝顺利。
2楼2011-12-12 08:17:36
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wanyifei0123

铜虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 同意! 2011-12-12 18:24:35
一般要对待切的载体做定量,琼脂糖凝胶初略定量就够了不用太精确,然后计算一下酶用量(1U差不多60min消化1ugDNA)。酶说明书上的用量一般没有问题,但是生产商用的底物和我们常常是不同的,所以最好适当调整——主要是要避免酶中的甘油在体系中的比例太大影响酶切效果。
3楼2011-12-12 08:20:26
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guojianping

木虫 (正式写手)


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一般来说NEB的1微升切2小时肯定是够了的,没什么需要算的精确的
4楼2011-12-12 19:33:26
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