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1楼 2011-12-07 19:47:58

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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

首先，楼主的RNA提的如何？反转录如何？引物退火温度是否合适？还有在这种情况下基因的表达量是否有参考文献？

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jiayoubashaonian

3楼2011-12-11 19:05:02

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wiln1

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

puguilin(金币+1): 2011-12-08 09:39:28

PCR不出带有多方面原因：
1.模板问题：含有抑制物或含量低。
2.酶失活：更换新的酶；
3.引物：引物质量、引物的浓度、引物是否容易形成二聚体；
4.变性对pcr扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。有时还有必要用标准的温度计(高精度的)，检测一下扩增仪温度情况。
5.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其pcr扩增是不会成功的；
6.是mg离子浓度过高、退火温度过低，及pcr循环次数过多有关；
解决方法：
1. 必要时重新设计引物。
2. 减低酶量或调换另一来源的酶。
3. 降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
4. 适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
5. 检查一下模板是否有问题，

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2楼2011-12-08 07:12:19

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puguilin

禁虫 (小有名气)

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4楼2011-12-11 21:25:33

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