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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA连接问题
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
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11楼2011-12-05 23:19:44
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lwtong8320

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by wcwluwei at 2011-12-05 23:19:44:
怎么在末端加上A 啊  求指教

如果是用T载体连接的话，就一定要末端有A的，Taq酶做PCR时，末端都会留有一个A的，胶回收或纯化后可以直接连接的。不知道你的DNA产物是怎么得来的，PCR还是提取的总DNA？
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12楼2011-12-07 19:41:17
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
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13楼2011-12-07 23:23:46
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hxy2011

金虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): Good 2011-12-08 19:06:01
若用Taq做PCR,1kb左右的片段连T载体很容易的。建议减少T载体的加入量。T载体加的太多，T载体容易自连，造成假阳性。
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14楼2011-12-08 09:53:30
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sxq大嘴

铁虫 (初入文坛)
你用的是什么聚合酶啊，加A的才行啊，如果不是这个原因就考虑一下载体与目的片段的比例合适不啊
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15楼2011-12-08 14:30:48
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
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16楼2011-12-08 19:01:24
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
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17楼2011-12-08 19:01:53
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c3024034

银虫 (正式写手)
你能保证你的片段已经切出你需要的粘性末端?  酶切没有问题？这些都需要验证清楚
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18楼2011-12-08 19:22:37
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hxy2011

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by wcwluwei at 2011-12-08 19:01:53:
载体就1ul  不多吧  10ul连接体系

太多了吧。我10ul的体系只加0.2-0.3ul的
溶液1:5ul
片段：4.7-4.8ul
T载体：0.3-0.2ul
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19楼2011-12-08 19:48:16
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lwtong8320

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by wcwluwei at 2011-12-07 23:23:46:
用的是天根mic  没问题

天根mic? 详细说一下，在天根目录中没见到这个酶呀！
如果是taq酶的PCR产物，应该没有问题的，连接体系再改进一下试试.
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努力！努力！再努力！
20楼2011-12-09 17:39:03
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