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电转化感受态细胞的制备
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1．电转化感受态细胞的制备 1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照） 2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。 3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。 5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。 6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。 8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。 9. 次日观察转化子生长情况，并记录。 2．连接产物纯化 1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂: 10ul of ddH2O 2ul of 3M NaAC（PH5.2） 50ul of 无水乙醇 轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上； 2.4℃，top Speed 离心30分钟； 3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物； 4.加入500ul70％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）； 5.4℃，top Speed离心5分钟； 6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味； 7.加入10ulddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用； 3.电转化 1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻； 2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。 3. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。 4. 打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。 5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部； 6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。 7．37℃，220－250rpm复苏1小时。 8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。 注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。 4.电击杯清洗流程 1． 用清水将电击杯稍冲一下。 2． 向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。 3． 弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。 4． 加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。 5． 弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。 6． 将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。 注：1．不同样品使用的电机杯应分开； 2．每周用1％酒精浸泡30分钟。 |
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