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HPLC中电化学检测器使用时的常见问题解答&&HPLC系统的酸清洗和钝化
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HPLC中电化学检测器使用时的常见问题解答&&HPLC系统的酸清洗和钝化 请多多支持！！！ |
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HPLC中电化学检测器使用时的常见问题解答&&HPLC系统的酸清洗和钝化
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HPLC中电化学检测器使用时的常见问题解答&&HPLC系统的酸清洗和钝化 权限不够，不好意思！！！ 我只有粘贴了！！！ PDF 格式在本人网盘上 www.SunnyRsGs.ys168.com [ Last edited by SunnyRsGs on 2006-12-6 at 14:03 ] |
2楼2006-12-06 13:54:17
HPLC系统的酸清洗和钝化
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HPLC系统的酸清洗和钝化 30％磷酸水溶液通过酸反应和强表面活性剂／洗涤剂的共同作用，可以有效地清洁不锈钢及其它润湿的部件。这一方法比更常用的硝酸“钝化”绝对更有效、且较少损害(特别是对日常使用低紫外波长的应用来说)。这一磷酸清洗步骤不是起钝化作用，但它是系统钝化前清洗的第一步。 一般来说，对于阳离子的离子色谱分析或配有氧化方式的电化学检测器以外的应用不需要钝化系统。因为有真空脱气机(每个通道体积为8m1)，可不必用磷酸；中洗全部通道。如果你计划四个通道都要用，则可用湿灌注的方式以4mL／min流速对每个通道清洗8～1 O分钟来清洗脱气机。这一步完成后你必须彻底淋洗管路，用水淋洗2～3次以便将磷酸从溶剂过滤头等部件冲洗净。 安装好的HPLC系统的酸清洗和钝化 HPLC系统内部可能的污染物来自人的触摸，暴露在实验室化学环境，与零部件制造相关的残留物，或来自先前的流动相和样品的残余物。 虽然系统自身也会逐步地被流动相清洗，但某些释放出的杂质会吸附在色谱柱上以及检测器润湿的表面上，因而会降低总的性能。 磷酸清洗： 通常用于从系统中除去有机杂质。可能是由于洗涤作用，它似乎比强有机溶剂更好也更快。这一步清洗必须在硝酸钝化之前完成。 硝酸钝化： 实际上是作用于不锈钢表面，在表面上生成均匀的氧化层。这层氧化膜保护不锈钢免受腐蚀(卤化物，螯合剂，等等)并且尽量减少浸出的金属离子进入流动相。 以下应用需要在使用前做磷酸清洗和硝酸钝化，包括： ①所有的氨基酸分析系统； ②所有包含电化学检测器的系统； ③所有要分析无机阳离子，包括过渡金属的系统； ④所有利用柱后添加衍生试剂或络合样品组分的系统。 以下应用需要在使用前只做磷酸清洗，包括： ①所有常规用途的、可能在低pH环境下在低紫外检测波长下运行的HPLC系统； ②所有需要高灵敏度性能的梯度紫外检测系统。 系统清洗指南： 注意：在实行这个程序时采用适当的安全防护措施准备工作： 首先，摘下色谱柱，用两通或接头取代色谱柱。在实行这一清洗步骤时，如果有可能选择监测的紫外波长为：254nm。通过软件或移去电缆的方式取消紫外检测器的自动回零功能。 具体步骤： 1、用甲醇彻底冲洗系统，以等比例方式通过泵的所有管路。 2、用水彻底冲洗系统，以等比例方式通过泵的所有管路。 3、以等比例方式通过泵的所有管路导入～30％v／v磷酸水溶液。以1mL/min流速洗大约一个小时。在冲洗期间活动所有的阀，包括：参比阀、进样阀及旁路阀等等。 4．用水彻底冲洗所有管路和系统。 必要时用6N硝酸(HN03)重复以上步骤。否则，跳到第7步。注意：硝酸是一个强紫外吸收溶液。除非绝对需要，不要做钝化程序。 5．以等比例方式通过泵的所有管路导人6N硝酸水溶液(大约是40％)。以1mL/min流速洗大约一个小时。 6．用水彻底冲洗系统，仔细检查是否有任何渗漏，在冲洗期间反复活动所有的阀，包括：参比阀、进样阀及旁路阀等等。 注意：如果你要用低于270nm的紫外波长作检测，则需要更大量水的清洗过程，不断的换新鲜水并活动各个阀(冲洗进样器，等)以便从系统中除去所有的痕量硝酸根离子。硝酸清洗后经常在几天之内都会观察到在低紫外波长下有负的基线漂移。勤换水和有耐心是尽快消除紫外本底的关键。 7．返回到甲醇洗，然后继续用实验所需的溶剂冲洗。 8．通过软件或接上电缆的方式重新使紫外检测器的自动回零功能恢复. |
3楼2006-12-06 13:55:10
HPLC中电化学检测器使用时的常见问题解答
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以下是HPLC中电化学检测器使用时的常见问题解答 一、如果基线噪音大或发生漂移（不稳）该怎样处理。 基线噪音大或飘移一般与高背景本底电流有关，而使背景电流变大的因素很多。下面例举一些有可能引发HPLC-ECD系统背景电流变大的因素。而除了大的背景电流外 还有别的因素可引起噪音。千万记住，下面例举的因素仅是一部分可能的因素，而且电化学电池本身不会产生特别的背景电流。背景电流是因分析条件、系统性能、已使用电化学电池的时间长短和处理电化学电池方法的不同而产生。 引发高本底电流的一般因素： 水！HPLC－ECD系统中使用的水非常关键，要求每厘米的阻抗必须大于或等于18兆欧姆。因而建议水要进一步的纯化，通过一种被称作洗水的过程。（参考ESA的技术说明“Water Polishing”文件目录号： 70-1668） 制备样品或制作流动相时使用了不纯（或被污染）的化学药品。样品本身也许就是污染源。氧化铝或在萃取时带入的杂质有可能会进入HPLC系统，从而污染色谱柱和电极。 流动相中的电化学活性试剂（如：EDTA，TEA）。EDTA是流动相中经常使用的一种试剂，用于螯合氧化的金属离子，可降低本底电流。在电势大于400毫伏时，这种化合物（EDTA）具有很高的电化学活性。如果工作电势大于400毫伏，流动相中就不能再使用EDTA而应改用柠檬酸盐来代替。TEA(三乙醇胺)是用来改善色谱峰的峰形。这种添加剂会含有电化学活性的杂质，在高电势时这种杂质会发生特别的氧化反应。因此要用最小量的TEA，典型的用量小于100μL/L或者对HPLC的色谱柱没有活性的用量. 系统中的不锈钢管可能被腐蚀。进入系统的污染物或腐蚀处的脏物可能引起电化学电池受污染（淤塞）或本底电流变大。建议用不锈钢管的用户需定期钝化系统管路或者换用PEEK管。PEEK管可直接从ESA购买。 如果脉冲阻尼器破裂，会有污染物进入系统，导致增大背景电流或压力升高。 其它引起噪音或漂移的来源： 泵头里有溶解于流动相中气体。泵压的波动通常与此有关。要确保流动相被很好的脱气。把泵停下来，等压力下降后，然后把泵清洗（purge）30秒。流动相在进入系统使用前要脱气（详情见下面的第6点） 电化学电池中有溶解在流动相中的气体。要确保流动相被充分脱气。 带清洗头的电化学电池（如：5014B和5041型电化学电池）在使用前可能没有被很好的清洗。 安培法电化学电极（如：5040和5041型电化学电池）有可能在目标电极处有小的泄漏。这主要是由安装垫圈和电极失误造成的。要牢记电极不能装的太紧，同时要确保在装配前所有部件必须完全是干燥的。 二、怎样清洗电化学电极？ 参见技术说明“Prolonging Cell Performance”（ 文件目录号：70-5017）。 它包含文字指导和技术说明以保障电化学电极在最好的状态下工作。 三、关闭系统时应注意什么？ 关闭电化学电极的电势。用适当的洗液清洗整个系统（看下面的注意）。在电化学电极关闭和泵中的液体停止流动时，并非系统中的所有设备都必须得断电。如果系统需长期存放建议断掉所有设备的电源。 注意：对于HPLC-ECD系统，设备的断电程序因其需停机时间长短不一而不同。 下面是不同情况下合理的断电程序 四、停机一晚上 非梯度系统--如果每天都在用此系统，应让ECD系统一直开着。在此情况下，关掉电化学电极并让流动相以 0.1mL/min 的低流速循环（看下面的第4点）。 梯度系统--对于梯度系统你不能再循环。而应使A和B各以50%的量组成流动相并使其总流速为 0.025mL/min运行系统， 流动相排到废液中。 五、长期停机 彻底冲洗系统以洗掉盐类物质。建议使用的冲洗剂应与实验时用的流动相一致，只是不再含有缓冲剂或盐类添加剂（如有机溶液和水）。注意！如果水或低浓度的有机溶液留在HPLC系统中时间很长有可能发生霉变并导致别的一些问题。对于硅填料的反向柱，水可能导致在线柱停留20到30分钟不能被使用。在冲洗完盐后，建议用柱子的生产厂家推荐的保存液再冲洗柱子，然后取出柱子并盖好盖子以防柱子变干。如果存放时间超过几个月，系统也应封存好。 注意：大部分EC应用的缓冲液盐浓度在50-100mM。如果没有流动，便有盐在 HPLC系统中沉淀。此沉淀能引起高的背压和鬼峰及其它问题。另外，没有有机溶液（如：甲醇）的水性溶液易长菌。为防止长菌，ESA推荐使用有杀菌作用的试剂如MB（产品号：70-1025）。 六、为什么要用孔径为0.22 μm的尼龙过滤器过滤流动相和样品？ 使用孔径为0.22 μm的过滤器有两个主要原因。 第一个原因是要滤去流动相中微粒以减少柱子的堵塞机会。第二个原因是库仑电化学电池里的工作电极是由多孔石墨制成的。石墨孔径大约为0.2μm。为防止多孔石墨被微粒堵塞我们强力推荐使用孔径为0.22μm的过滤器。另外，过滤器要放在电化学电池的前面，为保护电化学电池一定要在线过滤。过滤器不是很贵，如果被堵住很容易被更换。 过滤器架子（产品号： 70-0893） 石墨过滤膜(用于进样器前)（产品号： 70-0898） Peek过滤膜(用于进样器后)（产品号：70-3824） 七、可以让加电势的状态处于“On”一晚上吗？ 只要HPLC-ECD系统中的流动相（包含缓冲盐）一直处于流动状态是可以的。一些用户让系统运行，这取决于系统所需的平衡时间。若系统一直在运行，那么在跑样品前不需要平衡时间。然而，如果晚间泵出了故障，而电势依然加在没有流动相流动的电化学电极上，必然会损坏电化学电极。 请注意，如果对灵敏度的要求不高，如果所需平衡时间很短，在不运行系统时，最好关掉电化学电极或者使加在其上的电势为 0 mV 。这样通过减少电化学电极的工作时间和工作电流就可有效延长电化学电极的寿命，尤其是需要运行在高电势的情况下更应如此。 八、当我的基线以周期性的方式发生波动时我该怎么做？ 当基线以周期性的方式波动时此基线可描绘成锯齿状。人们经常会将噪音问题归罪于电化学电池。而事实上EC电化学电池很少引起这种周期性的噪音。大多数情况是这种噪音是由泵的问题引起的。可以通过测量锯齿波噪音的峰头和峰谷（或两峰头）间的距离来检测这种噪音是否由泵引起。先测出峰间距（设为D1），再把液相流速降为原来的一半后再测出峰间距（设为D2），如果D2与D1接近两倍关系，就可断定是泵出了问题。引发泵产生这种噪音的因素有很多，下面是四个最易产生的因素： 1.止回阀堵塞---参考泵的使用手册 2.泵头中有气体---灌注和清洗（purge）泵系统，赶出其中的气体 3.堵住了流动相的入口或管子入口 4.泵的局限性* *注意：由于在设计上不同泵产生无脉动基线的能力不同，在进行高灵敏度测量时一定要注意。电化学检测器比紫外检测器对噪音更敏感，故适用于紫外检测器的无脉冲基线的泵并不一定能适用于具有高灵敏度的EC检测器的应用。为尽量减小基线波动噪音，应在泵后装一个脉冲阻尼器，使基线更平稳。 小心！在装脉冲阻尼器之前一定要先询问泵的生产厂商。有些泵是不能装脉冲阻尼器的。 九、PH值会对电化学电极的响应有什么影响？ 在大多数情况下，低pH值（酸性环境）将能有效阻止有些分析物质被氧化。在低pH值环境，测量时物质氧化所需的电势会比中性或碱性环境高。反过来也是对的，高的pH值或（碱性环境）将有利于分析物质的氧化。 注意：在大多数情况下低pH值环境是用来防止分析物质（如：儿茶酚胺）自氧化。千万记住，选择不同的pH值将会影响化学分离，尤其是用色谱柱洗脱时的顺序。一般来讲不要太注重pH值对电极较高响应的影响，而应保证在自氧化最小的情况使被分析物质得到有效分离。建立伏安曲线（CV曲线）将有助于优化分析物质的响应。本文档的#8问题包含有关伏安曲线的信息。 十、我怎样确定能产生最大响应的最佳电势？ 注意：这一过程假设色谱条件不会变（如：能达到物质分离的一个稳定的色谱方法）。这一过程也要求操作者拥有电化学理论知识、懂得伏安曲线和操作Coulochem的基本知识。可参考Coulochem II操作手册中6.3,6.4a,和6.4b有关动态伏安曲线的情况。 1．根据待分析物的情况设置HPLC-EC系统 2．打开电化学电极，给电极加电势并要比文献提供的待分析物所需电势高出100 mV并让它平衡 3．给没有最优化的通道加电势到–200mV（记住每次只能优化一个电极。设定电极的电势为–200mV，基本可以消除正在该电极上氧化的物质） 4. 做一次已知浓度的标准物质的进样。 注意：标准物应是浓缩的（如：柱内有10到50 ng），但不要在或靠近检测器的检测限进行测定。以你认为能产生最大响应的电势跑一下此标准物将是非常重要的。 5．调整Coulochem上的增益或R值使你感兴趣的峰落在你所选范围的70~80%的区域内 注意：调整增益使峰变大并易观察但不能超出量程范围。一旦增益或R值被设定，那么在整个过程中它们都得保持不变 对库仑阵列电化学检测器（CoulArray）来说，会自动调节量程范围，所以无需选择。 6．接下来，加电势到感兴趣电极，并且电势值要比前面进样时低50mV。让基线稳定下来并使检测器自动归零。 7．一旦基线稳定下来就可以进标准样。确保色谱图是完整的和可以接受的。记录最终的高度和面积。 8．每次把电势减少50mV重复上面的6和7直到看不见峰高和峰面积为止。 9．以峰高为Y轴，所加电势为X轴，分别画出每种化合物的变化曲线。 10．在您的方法中，当电势增加时，峰高和峰面积已达到最大，增加电势不会再增加峰高和峰面积时，应选择能达到最大面积时所需的最低电势作为工作电势（如：如果获得最大峰响应的电势为450, 500 and 550mV, 选择400mV为工作电势）。 十一、对于我的电化学电极，pH操作范围应是多少？ 对于大部分情况，操作环境的pH范围在1-12都不会损坏电化学电池或其部件。但是，当使用极端pH时，一定要多加注意。要意识到pH呈碱性和大的背景电流同时作用将损坏电化学电池。还有，色谱柱对 pH值的限制要求也要特别注意。一定要确保色谱柱适于你的pH环境，否则，不适宜的pH将使色谱柱的填料有可能进入测量系统污染或损坏电化学电极。 十二、多久更换一次过滤膜？ 理想的色谱条件下过滤膜是不需要更换的，然而在实际中因其被堵塞，是一定要定期更换的。更换频率视流动相和样品中的颗粒物质进入系统的情况而定。 压力的增大提示我们，或许是应换过滤膜的时候了。建议每天使用系统时都要做压力变化的日志。要检查系统压力开始升高是否是系统上的第一个过滤膜引起的。等待压力的下降。在系统内还有压力时不要拆除HPLC系统。断开过滤器后面的管道，让流动相流过过滤器。记录此时的压力后拆除过滤器，再记录压力值，然后用前面的记录值减去此值。如果差值大于8-10 bar（或100 psi），就应换掉这个过滤膜。用同样的方式检查其它的过滤膜。 注意！拆除过滤器前，一定要确保电化学电池被断开和系统压力低于10 bar。 如果过滤膜需更换的频率过于频繁，就要对系统进行进一步的检查。可根据下面的方法确定堵塞过滤膜的颗粒来源。如果泵后面的过滤膜需经常更换，说明流动相（包括长菌）或泵的密封圈有可能出了问题；如果进样器后面的过滤膜需经常更换，说明样品有可能有问题；如果柱子后面的过滤膜需经常更换，说明问题可能出自柱子。虽然记住这些将会得到解决问题的很好指导，但也不是绝对的。当处理HPLC系统的压力问题时，一定要充分做好系统分析和逻辑思考，尽量想到各方面的可能性。 十三、我能用硝酸清洗电化学电极吗？ 不建议用硝酸清洗电化学电极。只有在其它方法处理不再有效时，才用硝酸做电化学电极的最后一次清洗。决不能让色谱柱接触硝酸。有关电化学电极的清洗说明请参见Coulometric Sensor Technical Note 文献号：70-1989. 当用硝酸处理电化学 电极时决不能给其施加电势。用硝酸清洗电化学电极将使电化学电极的所有保修为无效。可用6N硝酸来清洗或钝化EC-HPLC系统的不锈钢件。有关用硝酸清洗电化学电极的指导说明可参见Coulochem II 操作手册的8.5部分。 如果用硝酸钝化HPLC系统中的不锈钢件, 可参见Coulochem II 操作手册的4.3部分。 十四、阀门的故障处理 造成两次进样所得的峰响应不太一致的原因可能是因进样方法或进样器有问题。有关手动进样的故障信息，请访问网址：www.rheodyne.com. 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