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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

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专业: 植物遗传学

[交流] 【转】我在SDS-PAGE中所犯的错误，欢迎补充！已有29人参与

(1)我的SDS-PAGE 用了半年却还能用。10%SDS溶液两年了目前好着呢，他是结晶的用前热水浴溶解即可，常温保存。AP用一个月肯定没有问题。TEMED好像用了10年了，没有问题，不可思议。但快过期的甲叉试剂会使胶凝固时，梳子的齿处长短不齐。
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(2)我们用的是Invitrogen的kit, 我做的不多，只做过GFP，也列下错误：
1. 用错了running buffer,跑出来的带呈彩虹弧形，而且跑得非常慢
2. 第一次抗体浓度过高（1/500），跑出来的带看不出浓度差异，第二次一级抗体和耳机抗体的稀释比率分别是（1/1000和1/4000），效果比较理想。
3.目前正在进行中的是一次跑两批蛋白(两张胶），但是出来结果一张有一张白版，不知道是什么原因。。。
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(3)我也是刚进实验室，尽犯些不该犯得小却致命的错误，每次都懊恼得想撞墙，现得一结论，做实验一定到认真，每次都把protocol重写一边，做到哪划到哪，省得出错。
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(4)今天第一次灌胶所用设备为BIO-RAD 为防止漏胶先在下层小心铺一层速凝胶
（可在加TEMED之前取0.5ml分离胶液于另一小器皿中然后加入10微升TEMED 然后灌速凝胶）静置3分钟后按常规方法灌分离胶浓缩胶，结果未见漏胶情况发生。另外本人在流水冲洗下拔梳子结果未见梳孔歪斜情况发生。第一次灌胶即比较成功。
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(5)我的错误才搞笑，刚进实验室时做胶，
分离胶的配方和浓缩都弄成一样的了．
还和别人讨论错误在哪里？怎么总是在分离胶就有带
狂晕ing～～
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(6)一次有个师弟过来告诉我,他的SDS-PAGE上不了样
我有些奇怪,过去看究竟,果然,他把样品加入点样孔之后,样品不是沉到底部,而是象兰色烟雾一样从孔内飘起来,很快飘散干净
感觉是样品忽然变轻了,或者----电泳缓冲液变重了
后来发现原因是后者,原来他倒错了电泳缓冲液,把10倍的缓冲液倒进了电泳槽,换回来就行了
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(7)我是新手正在做WB，我想请教各位高手一个问题，我跑了三次胶每次都跑成哭脸，我求助过一些高手，说可能是胶的底部有气泡所致，我仔细看了我作的胶底部确实有许多气泡，不论我怎么小心，有时在刚灌完分离胶时没有明显的气泡，静置一会后在胶的底部回出现许多小气泡，这是什么原因呢？
胶凝固后体积会缩小。你可以加少许缓冲液后把槽倾斜，将气泡赶掉。
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(8)我所犯的错误也不少。
没加BUFFER就煮蛋白样品，结果全沉淀了，样品只能扔掉。
转膜忘了冰浴。不过，作出来的结果没有受到影响。
膜上面忘了标记号，做完了不知道是什么样品了。建议用铅笔在MARKER的位置标个记号。
胶冬天气温低时不容易凝固，可以将AP，TEMED加倍，放在37度里。
AP，TEMED，每次配1ml都是放四度，最长可能用了2个月没问题，SDS放在室温，1年了，好像没什么影响。
不要迷信进口抗体，进口抗体也会有时候做不出来。
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(9)我们也是加大AP浓度来加快凝胶速度的，不过有一次加大太多，凝得太快跑出来条带有点歪歪扭扭的，不好看，建议30min左右聚合就可以了，太快也不好。
另外我们图便宜，用了国产的槽。还不错，跟借来的Bio-rad差不多，不用封，也不漏胶，只是没有那个塑料剥胶板，便宜啊！这样已经不错了！
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(10)我觉得防止记错加样顺序的方法可以是，MARKER两边加不同个数的样本。如：MARKER左边加了4个，右边加了5个。脱色完了，一看就明白了。
我就是这样干的，个人有点懒，就经常用这个方法
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(11)前些日子做SDSPAGE，做了两天，犯了一大堆错误，写出来供大家借鉴：
1 听有人说琼脂粉可以做封底胶，一试，漏了，还是用琼脂糖吧。
2 AP用别人旧的，结果胶不干
3 A液，B液用旧的，不干。
结论：不要用别人的，一定要自已配，别怕浪费。
4 前后Tris 的PH值搞错，结果不凝
5 电泳时长板接负极，反了
6 剥胶时，忘了切角，自已都不记得哪是哪的。
再剥时，分离胶与积层胶分开了，又搞不清什么是什么了。(可以用注射器向胶与玻璃之间注水，就可以很完整的剥下来。)
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(12)我们也是bio-rad的不用封底，对于APS个人觉得每个实验室应该形成一种规则，就是所有配置的溶液都写上日期和标签，并注明操作的人名，这样是一种负责的态度，除了问题很溶液找到来源，另外日期可以很明白判断是否过期，APS一般一个星期4度下，浪费也是可耻的，不要把实验室的东西不挡自己的。另外配置母液的时候最好用超纯水，这样配置的缓冲液放一年都没有什么问题。
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(13)要想跑出好的胶，有条件的可以在最后加入APS或TEMED前，给混合的溶液脱脱气，效果会好些。
列举一些新人犯的错误：
1 配胶时加错试剂；
2 电泳时未通电或未及时通电；
3 先上样后加缓冲液；
4 正负极搞反；
5 缓冲液没加够，浸没不了浓缩胶，电路不通；
6 样品煮完没离心；离心是为了去除不溶性颗粒，不然会影响电泳。
7 电泳时未用的上样孔没1X上样缓冲；
8 电泳过程中漏液等
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(14)我也说一下自己遇到的问题
1.胶凝时放入37度温箱，谁知温度比设置的高了一两度，胶凝后发现边缘不平整，所以后来我一直将温度调在34度，没出过问题，呵呵
2.配好分离胶后，液面用异丙醇封闭，用枪加异丙醇时太猛了，使胶边缘凝聚的不平整。所以以后加异丙醇时要轻轻的。

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 16:32 ]

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