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forrest123

铜虫 (小有名气)

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[交流] 科学家在DNA去甲基化机制研究中发现新的修饰碱基已有7人参与

高等生物的DNA中，有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）4种常见的碱基形式。而我国科学家最新研究表明，除A、G、T、C四大碱基及两种与C相关的碱基修饰形式外，还存在第7种碱基。中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所徐国良研究组近日在《科学》杂志发表论文，初步阐明了DNA去甲基化的机制与过程，宣告人类发现了这个生命编码过程中的“新单词”。这意味着人类对自身受精卵变为胚胎细胞的内在机制有了更深理解。

甲基化是核酸的一种重要修饰，调节基因的表达和关闭，与动植物生长发育、疾病发生发展有密切关系。以往研究已知，DNA四大碱基还有两种修饰形式，即第5种碱基5mC、第6种碱基5hmC，它们均包含甲基（m）这个“词缀”，是甲基化的碱基。DNA甲基化会关闭某些基因的活性；而反之，DNA去甲基化则会诱导基因的重新活化及功能表达。在生殖细胞形成、受精卵向胚胎发育过程中，就出现大规模的全基因组去甲基化，成为非常重要的“生命编码”环节。

徐国良研究组及其合作方通过研究发现，无论是体外的细胞还是培养的细胞，DNA第5、第6种碱基可以进一步形成第7种碱基5caC。这种新的修饰碱基会被自动识别出来，并从基因组中切除，再通过DNA的剪切修复，替换为没有修饰成分的胞嘧啶。

专家认为，此项研究的重要意义在于，发现了第7种碱基作为中间状态确实存在，还锁定了参与其中的特定的酶，这为DNA去甲基化机制研究提供了生物化学证据，也为下一步研究指明了方向。

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-6 at 20:23 ]

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2011815

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1楼 2011-08-15 13:35:27

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jinwozzf

新虫 (初入文坛)

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中关村华康基因研究院应用高通量技术进行DNA甲基化区域检测
近年来，作为表观遗传学中的重要组成部分，DNA甲基化的研究升温。利用重亚硫酸盐处理，将没有甲基化保护的胞嘧啶转化为尿嘧啶，通过检测未转化胞嘧啶的比例，可以精确测定甲基化程度。目前常用的重亚硫酸盐转化后的检测手段有4种，但是存在诸多不足：
1. 重亚硫酸盐处理加克隆测序。该方法被视为测定甲基化程度的金标准，原理是将基因组进行重亚硫酸盐转化后，对目标区域进行PCR扩增，克隆到载体后，转化细菌，挑取单克隆后进行测序。但是由于每个目的区域都要经过一系列繁琐的操作，并且受费用限制，每个区域一般只测序10-20个克隆，降低了甲基化程度定量的分辨率（测序10个克隆的分辨率为10%，20个克隆的分辨率为5%）。当对多个目标区域检测时，非常费时费力且价格昂贵。
2. 荧光实时定量PCR。该方法的优点是相对快速。缺点是只能对甲基化程度进行总体估测定量，无法得到每个碱基的甲基化值。且受限于甲基化特异探针或引物只能识别所检测区域内的某几个CpG，无法对区域内所有CpG的甲基化进行评估。最终得到的结果是基于区域内某几个CpG甲基化的组间相对改变，无法得到每个碱基在某个样本内的甲基化绝对比例。
3. 焦磷酸测序。焦磷酸测序可以检测重亚硫酸盐转化后PCR产物中每个CpG位点中C的百分比，但是准确度不够理想，尤其是在高甲基化或低甲基化状态时。另外，焦磷酸测序虽然可以得到每个CpG位点的磷酸化状态，但是却无法判断其等位基因来源。
4. Sequenom质谱检测。可以检测每个位点的甲基化程度，但是步骤比较繁琐，要经过PCR，克隆，体外转录等一系列操作。Sequenom质谱的分辨率一般，大于5%。另外，此方法比较困难分辨不同等位基因来源的CpG。
综上所述，目前市场上尚缺少能够对多个候选区域的甲基化状态进行精确测定的简便、快速且价格低廉的检测手段。科研工作者在拿到全基因组甲基化检测结果后，需要对其中比较重要的多个候选区域进行大样本精确验证时，往往一筹莫展。对于某些候选基因甲基化的科研工作者而言，同样如此。
应用新一代高通量测序平台开发的多区域多样本的甲基化检测技术主要针对需要在多个样本中检测多个候选区域的科研工作者，其优势有如下几项：
1. 准确。达到甚至超过目前的金标准-重亚硫酸盐转化加克隆测序。
2. 分辨率高，小于1%（相当于重亚硫酸盐加克隆测序法检测了100个克隆以上），大大优于重亚硫酸盐转化加克隆测序。
3. 可以实现单碱基绝对定量，对目标区域内每个CpG的胞嘧啶进行检测，并提供相应的绝对甲基化比值。
4. 可以分辨不同等位基因的不同位点的甲基化，可以进行同一区域内不同CpG位点的甲基化协同性分析。
5. 可以分析多态位点对周围CpG甲基化的影响。
6. 根据客户需要，可以区分母系和父系来源的DNA甲基化差异，方便遗传印记研究（genomic imprinting）。
7. 根据客户需要，可检测基因组正义链和反义链的甲基化，对双链DNA的非对称甲基化进行研究。
这一技术可以同时对多个样品的几十甚至上百个区域同时进行甲基化序列分析，能够快速、准确的筛选出真正有显著意义的区域或位点，完美实现科研思路，同时大大节省时间成本和经费。